أديبو--واضحة: منديل مسح طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الدهنية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الأنسجة الدهنية ، مثل كيفية تفاعل المكونات المختلفة للأنسجة الدهنية في الأنسجة بأكملها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تزيل تماما الدهون الزائدة المخزنة في الأنسجة الدهنية مع الحفاظ على بنيتها ثلاثية الأبعاد. في حين أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتلك المنظمة ثلاثية الأبعاد للأنسجة الدهنية ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقها بشكل عام على الأنسجة الأخرى ذات المحتوى الدهني العالي مثل الغدة والغدة الليمفاوية.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن خطوات إزالة الدهون والمقاصة تتطلب أوقات حضانة كافية ، والتي قد يكون من الصعب تحديدها. ابدأ باستخدام ملقط غير حاد لتشريح الوسادة الدهنية ذات الأهمية من نموذج حيواني حديث الانتشار. قم بإزالة وسادة البدعة بالكامل بعناية دون الضغط على الأنسجة أو تلويث الأنسجة المقطوعة بالفراء.

ضع وسادة الدهون في حوالي 10 مل من محلول التثبيت في أنبوب مخروطي 15 مليلتر وقم بإصلاحه عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي بعد غسل العينة باستخدام PBS ، قم بإزالة أي حطام برفق من العينة تحت مجهر التشريح. سيؤدي الشعر أو الوبر أو أي حطام آخر متصل بالعينة إلى ظهور ظلال أثناء التصوير.

انقل العينة النظيفة إلى أنبوب بولي بروبلين يحتوي على محلول بارد مثلج بنسبة 20 بالمائة من الميثانول B1N. ضع الأنبوب الذي يحتوي على العينة أفقيا على شاكر مداري ، واضبطه على 100 دورة في الدقيقة ، ورجه لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة حسب حجم العينة. تأكد من أن العينات يمكن أن تتحرك بحرية داخل الأنبوب.

استمر في تجفيف العينات من خلال سلسلة متدرجة من 40 في المائة و 60 في المائة و 80 في المائة من الميثانول في المخزن المؤقت B1N متبوعا بالميثانول بنسبة 100 بالمائة. قلل من الحل المرحل. بعد الجفاف ، استبدل محلول الميثانول بنسبة 100 في المائة بثنائي كلورو ميثان بنسبة 100 في المائة أو DCM لإزالة الشحوم من العينة.

كرر الغسيل مرتين بعد أوقات الحضانة المدرجة في الجدول 2. يجب أن تغرق العينة في قاع الأنبوب في نهاية غسلات DCM الثانية والثالثة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتمديد وقت الحضانة لضمان إزالة الدهون بالكامل.

بعد إزالة الشحوم ، اغسل مرتين بالميثانول بنسبة 100 في المائة للوقت الموضح في الجدول 2. أعد ترطيب العينة في سلسلة عازلة من الميثانول B1N معكوسة للأوقات المشار إليها في الجدول 2. بعد الجفاف ، اغسل العينة باستخدام عازلة PTXWH لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

العينة جاهزة الآن للتلوين المناعي أو يمكن تخزينها في مخزن مؤقت PTXWH عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى عام واحد. أولا ، قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي في المخزن المؤقت PTXWH إلى التركيز الموصى به. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لمحلول الأجسام المضادة المخفف عند 20 ألف جرام لمدة 10 دقائق لمنع إدخال رواسب الأجسام المضادة أو التجميعات.

من المهم اختيار الأجسام المضادة الأولية المناسبة المتوافقة مع علاج الميثانول و DCM. يجب التحقق من صحة الأجسام المضادة الجديدة بقطع صغيرة من الأنسجة أو بأقسام الأنسجة المعالجة بالميثانول. احتضان العينة المخففة للدهون بمحلول الجسم المضاد الأساسي لمدة 3 إلى 5 أيام حسب حجم العينة.

بعد الحضانة الأولية ، اغسل العينة بعدة تغييرات في المخزن المؤقت PTXWH. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي في المخزن المؤقت PTXWH إلى التركيز الموصى به. جهاز الطرد المركزي لمحلول الأجسام المضادة المخفف كما كان من قبل.

احتضان العينة بمحلول الجسم المضاد الثانوي لمدة 3 إلى 5 أيام حسب حجم العينة. مرة أخرى ، اغسل العينة باستخدام المخزن المؤقت PTXWH في سلسلة من خطوات الحضانة كما كان من قبل. في اليوم التالي ، اغسل العينة ب 1XPBS لمدة 5 دقائق و 10 دقائق ثم 30 دقيقة.

قم بتضمين الأنسجة الدهنية في الاغاروز لتسهيل تركيب العينة للفحص المجهري للصفائح الضوئية. أولا ، قم بإعداد محلول التضمين مع 1 في المائة من agarose في 1XPBS. قم بتبريد محلول التضمين إلى حوالي 40 درجة مئوية لتجنب تعريض العينة للحرارة الزائدة.

مع تجنب ترحيل السوائل ، ضع عينة الأنسجة النظيفة في قالب ورتبها في الموضع المطلوب. ثم اسكب محلول التضمين برفق فوق العينة مع تجنب فقاعات الهواء. يجب نقل أي فقاعات هواء إلى المحيط قبل أن يتجمد الاغاروز.

بمجرد أن يصلب الاغاروز تماما ، اقطع كتلة تحتوي على العينة. انقل العينة إلى 25 في المائة من الميثانول في الماء ، واحميها من الضوء ، واحتضانها بالاهتزاز للوقت الموضح في الجدول 2. استمر في تجفيف العينة من خلال تدرج الميثانول.

احتضان العينة في 100 في المائة DCM لمدة 1 ساعة مع الرج. تجف العينات المغسولة DCM بسهولة في الهواء ، مما قد يؤثر على وضوح العينة وينتج عنه صور ضبابية. من المهم نقل العينات بسرعة إلى محلول جديد لمنع الجفاف.

يجب أن تغرق العينة في قاع الأنبوب في نهاية كل غسلة DCM. احتضان العينة في ديبنزيل الأثير أو DBE طوال الليل مع اهتزاز خفيف لتحقيق مطابقة معامل الانكسار. ستصبح العينة في النهاية ضوءا شفافا وغير مرئي.

في اليوم التالي ، بعد احتضان العينة ب DBE الطازج مع اهتزاز خفيف لمدة ساعتين ، قم بتخزين العينة في درجة حرارة الغرفة في الظلام أو انتقل مباشرة إلى التصوير. لتصوير العينة باستخدام مجهر صفائح ضوئي متوافق مع DBE ، قم بتركيب عينة الاغاروز المدمجة على حامل يمكنه منع الحركة أثناء التصوير. لتصوير العينة باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب أو ثنائي الفوتون ، ضع عينة الاغاروز المضمنة في شريحة غرفة ذات قاع زجاجي.

يظهر مسح وسادة الدهون الخلفية تحت الجلد باستخدام مجهر ورقة ضوئية مع تكبير منخفض التنظيم الفصيصي للخلايا الشحمية. يمكن الكشف عن معلومات أكثر تفصيلا مثل حجم الخلايا الشحمية من خلال تكبير المناطق ذات الاهتمام بتكبير أعلى. تم تصوير وسادة دهنية خلفية تحت الجلد ملطخة بهيدروكسيلاز التيروزين ، وهي علامة للجهاز العصبي الودي بواسطة الفحص المجهري لإزهار الورقة الخفيفة.

كشف تلطيخ TH عن هياكل تظهر على شكل حزم عصبية كبيرة كما هو موضح في السهم هنا. يتم أيضا الكشف عن تعصيب الأوعية الدموية وكذلك الأشجار الطرفية الكثيفة في أنسجة الحمة من خلال تلطيخ TH. باستخدام جزيء التصاق الخلايا البطانية للصفائح الدموية أو PCAM1 المعروف أيضا باسم CD31 كعلامة لتسمية الأوعية الدموية ، لوحظ أن جميع الخلايا الشحمية على اتصال بالشعيرات الدموية في جميع أنحاء الأنسجة بأكملها مما يدعم الطلب المرتفع على تبادل المغذيات والأكسجين الفعال في الدهون

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الدهون لاستكشاف أسئلة إضافية مثل تشكل الأنسجة المبكر ورسم خرائط مصير أسلاف الخلايا الشحمية. يمكن أيضا تطبيقه لدراسة أنسجة الأنسجة الدهنية البشرية. لا تنس أن العمل مع بارافورمالدهيد والميثانول وثنائي كلورو الميثان وثنائي بنزيل الأثير يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام غطاء الدخان ومعدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.