الكشف المناعي 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في تطوير والشبكية الماوس بوستميتوتيك

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مثيلة الحمض النووي ، مثل التغيرات في الكروماتين أثناء نمو الشبكية في شبكية العين بعد الانقسام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها بقوة على أي أقسام من جميع أنسجة شبكية العين الفئرانية التي تحمل توزيع 5-ميثيل سيتوزين ، 5-هيدروكسي ميثيل سيتوزين التي تتم معالجتها في نهج مماثل. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات تحضير الأنسجة وتلوينها ، لأنه إذا تم استخدام الاستعدادات النسيجية المجمدة ، فقد تفقد الأنسجة التنظيمية والأصلية القيمة.

سيوضح بقية الإجراء بابلو دياز ، باحث مشارك من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء ، استخدم إبرة قياس 29 بوصة نصف بوصة لثقب عيني فأر مقطوع الرأس على الجانب الظهري للعينين. للحصول على أكواب العين ، قم باستئصال العينين على الفور عن طريق قطع الصلبة بمقص عيون ناعم لإزالة القرنية والعدسة.

ثبت أكواب العين و E16 العيون الكاملة في 4٪ بارافورمالدهيد أو PFA في 1xPBS درجة الحموضة 8.0 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسلها مرتين في مليلتر واحد من 1xPBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. لحماية أكواب العين والعينين الكاملة بالتبريد ، احتضنها في 1xPBS درجة حموضة 8.0 مع 10٪ سكروز في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

ثم في 20٪ سكروز في 1xPBS لمدة ساعة واحدة. وأخيرا في 30٪ سكروز في 1xPBS عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بتضمين أكواب العين والعينين في مركب درجة حرارة القطع الأمثل ، أو OCT ، في قوالب التبريد.

ثم قم بتجميدها في حمام الإيثانول الثلجي الجاف واحتفظ بها عند 80 درجة مئوية. قبل البدء في التقطيع بالتبريد ، قم بإزالة القوالب باستخدام أكواب العين والعينين المدمجة من 80 درجة مئوية. ضعها في حامل ناظم البرد واتركها تتوازن إلى 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

باستخدام ناظم البرد عند 20 درجة مئوية ، قم بقص المقاطع العرضية للشبكية بسمك 12 ميكرومتر بالتوازي مع المحور الصدغي من خلال رأس العصب البصري. قم بتركيب الأقسام على شرائح المجهر وتخزينها على حرارة 80 درجة مئوية. لبدء التلوين المناعي ، استخدم قلما حاجزا مسعورا لتطويق أقسام الشبكية المثبتة على الشرائح.

اغسل الأقسام مرة واحدة ب 200 ميكرولتر من 1xPBS لمدة 10 دقائق. تخلل الأقسام ب 200 ميكرولتر من PBST لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتغيير طبيعتها ب 200 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك العادي الطازج المصنوع بعناية في 1xPBS لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتحسين إشارة 5 مللي متر مكعب.

بعد التمسخ ، أضف 100 ميكرولتر من 0.1 Tris-HCl pH 8.3 على أقسام الشبكية ، واحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحييدها. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول الحظر. واحتضان الأقسام في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

أضف الأجسام المضادة المناسبة ، المخففة من واحد إلى 500 في محلول مانع ، إلى الأقسام واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الأقسام ثلاث مرات لمدة 10 إلى 15 دقيقة لكل منها بنسبة 0.1٪ PBST. أضف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المخففة من واحد إلى 1000 في محلول مانع يحتوي على محلول DAPI في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من 0.1٪ PBST لمدة 10 دقائق لكل منها. بعد الغسيل الأخير ، أضف وسط تركيب مائي. غطيها بغطاء.

ثم تابع الفحص المجهري متحد البؤر. بعد تلطيخ الشبكية المناعي في E16 ، كانت إشارة 5mC قوية في المراكز الكروموسية لنوى الخلية وموجودة عند مستوى أقل بكثير في نوى الخلية بأكملها. تم العثور على تلطيخ 5hmC حصريا في نوى الخلية وغائب عن مراكز الكروموس.

في شبكية العين P0 ، كانت كل من إشارات 5mC و 5hmC موجودة في طبقة الخلايا العصبية الخارجية ، وطبقة الخلايا العصبية الداخلية. كانت إشارة 5mC قوية في مراكز اللونات والمحيط النووي لنوى الخلية ، وأضعف بين المراكز الكروموسية لنوى الخلية. اقتصر تلطيخ 5 hmC على نواة الخلية.

في شبكية العين P15 ، في الطبقة النووية الخارجية ، تم اكتشاف إشارة 5mC في المراكز الكروموسية لنوى الخلية والمحيط النووي. في حين أن إشارة 5hmC كانت في نوى الخلية بأكملها باستثناء مراكز الكروموس. في الطبقة النووية الداخلية وطبقة الخلايا العقدية ، كانت إشارة 5mC قوية في مراكز الكروموكورات لنوى الخلية ، وضعيفة في نوى الخلية بأكملها.

بينما تم العثور على إشارة 5hmC في نوى الخلية بأكملها باستثناء مراكز الكروموس. في المستقبلات الضوئية للقضبان البالغة ، اقتصرت إشارة 5mC على مركز اللونوم والمحيط النووي ، بينما اقتصرت إشارة 5hmC على المحيط النووي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر علاج الأقسام النسيجية بالتعرض الأمثل ل HCl ، وهو 30 دقيقة.

إذا كان التعرض أقل أو أكثر ، فلا يمكن تكرار النتائج المثلى. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط ، وقياس الطيف الكتلي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل القياس الكمي للتغيرات في قياس 5-ميثيل سيتوزين و 5-هيدروكسي ميثيل سيتوزين. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التطور العصبي لاستكشاف التغيرات اللاجينية في الكروماتين.

لا تنس أن العمل مع حمض الهيدروكلوريك و PFA يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل التخلص السليم ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.