Name: الكشف المناعي 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في تطوير والشبكية الماوس بوستميتوتيك (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: اكتشف بروتوكول الكشف المناعي لعلامات 5mC و5hmC الإيبيجينية في شبكية الفأر أثناء التطور. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة تغيرات الكروماتين في الأنسجة العصبية بعد الانقسام.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل بمنحه SBIR (1R44EY027654-01A1).

وأجريت جميع الإجراءات مع الفئران وفقا لبروتوكولات وافق عليها مستشفى أوكلاند معهد بحوث الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة الأطفال والتقيد برابطة البحوث في بيان الرؤية و "طب العيون" (آرفو) لاستخدام للحيوانات في العيون والرؤية للبحث.
1-الأنسجة التحضير إيمونوستاينينج
<ol><li>Euthanize فئران C57 BL/6J في يوم الجنينية (ه) 16، يوم بعد الولادة (ف) 0, P15 و P90 بثاني أكسيد الكربون (CO2) متبوعاً بقطع الرأس (الفئران E16 و P0).</li>
	<li>عيون الفأر فورا انوكليتي ثقب بإبرة 29 1/2 في الجهة الظهرية من العين. احتضان لمدة 5 دقائق (دقيقة) في 1 مل من 4% بارافورمالدهيد (PFA) في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (1 x PBS) pH 8.0 في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>جعل الكؤوس العين من P0, P15 و P90، تشريح خارج القرنية والعدسة مع مقص العيون الجميلة في حين العيون في 4% منهاج عمل بيجين. ملاحظة: تخطي هذه الخطوة لعيون E16 كالعيون صغيرة جداً.</li>
	<li>إصلاح العين الكؤوس (P0 و P15 و P90) وعيون كله (E16) في 4% منهاج العمل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل الكؤوس العين والعيون كلها مرتين في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>كريوبروتيكت العين كوب وعيون كله في 1xPBS، pH 8.0 تحتوي على السكروز 10% لمدة ساعة واحدة. الاحتفاظ في السكروز 20% في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة وتشبع ثم في السكروز 30% في برنامج تلفزيوني س 1 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>في اليوم التالي، تضمين الكؤوس العين والعيون كلها الأمثل خفض درجة الحرارة مجمع (OCT)، (500 ميليلتر) في كريومولدس وتجميد المفاجئة في حمام الثلج الجاف/إيثانول، وتخزينها في-80 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة القوالب مع الكؤوس العين جزءا لا يتجزأ وعيون كل من-80 درجة مئوية، والسماح لحجته إلى-20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل كريوسيكتيونينج.</li>
	<li>قطع المقاطع العرضية الشبكية (12 ميكرومتر سميكة) موازية للمحور تيمبوروناسال عن طريق رأس العصب البصري باستخدام كريوستات في-20 درجة مئوية.</li>
	<li>تحميل المقاطع الشبكية على شرائح المجهر53 ومخزن في-80 درجة مئوية.</li>
</ol>2-إيمونوستاينينج مع الأجسام المضادة 5 mC و 5-مؤسسة حمد الطبية
<ol><li>تطويق المقاطع الشبكية التي شنت على الشرائح بقلم حاجز مسعور. القلم حاجز الماء يقلل حجم الأجسام المضادة المطلوبة لوصمة عار في الأنسجة.</li>
	<li>تغسل أجزاء الشبكية مرة واحدة مع 200 ميليلتر 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>بيرميبيليزي المقاطع الشبكية مع 200 ميليلتر من 0.1% X-100 تريتون في 1 x برنامج تلفزيوني (برنامج تلفزيوني-تي) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تؤذي المقاطع الشبكية لمدة 30 دقيقة مع 200 ميليلتر من طازجة 2 حمض الهيدروكلوريك (HCl) ن في س 1 برنامج تلفزيوني في حاضنة 37 درجة مئوية. ملاحظة: مطلوب معايرة دقيق المعاملة HCl لتحسين إشارة 5mC.</li>
	<li>وتشمل دائماً replicates البيولوجية (3-4) حين الأمثل 5mC إشارة54. ملاحظة: قمنا باسترجاع مستضد في 4 نقاط زمنية (15 دقيقة، 30 دقيقة، ح 1 وح 2) والحضانة وجدت 30 دقيقة الأمثل لإشارة 5mC. حضانة أطول مع HCl يحط هيكل النوى مما يؤدي إلى عدم القدرة على ترجمة 5mC إشارة إلى النواة.</li>
	<li>بعد تمسخ، تحييد المقاطع الشبكية بإضافة 100 ميليلتر من 0.1 متر تريس-HCl (pH 8.3) في أقسام الشبكية لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>احتضان الفروع في 500 ميليلتر من عرقلة الحل (مصل الماعز العادية بريمن 5% في 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 1 x) عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطوبة.</li>
	<li>وبعد تجميد، إضافة مكافحة--5mC؛ الأجسام المضادة 5hmC المخفف 1: 500 في عرقلة حل للمقاطع الشبكية.</li>
	<li>احتضان الشبكية المقاطع بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في دائرة الرطوبة.</li>
	<li>الغسيل اليوم التالي، المقاطع الشبكية 3 مرات (10-15 دقيقة في كل مرة) مع 0.1% PBS-T واحتضان ثم في عرقلة الحل مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة (الماعز المضادة الأرانب والماعز الماوس المضادة مفتش، تضعف؛ 1: 1000)، التي تحتوي على DAPI (4 ', 6- دياميدينو-2-فينيليندولي) الحل (1 ميكروغرام/مل) في درجة حرارة الغرفة ح 1 في عرقلة الحل. ملاحظة: تجنب تجفيف الأقسام خلال جميع مراحل إيمونوديتيكشن.</li>
	<li>يغسل الشرائح الوقت الثلاثة مع 1 مل من 0.1% برنامج تلفزيوني-ت.</li>
	<li>بعد الغسيل الأخير، جبل المقاطع مع المتوسطة تصاعد مائي تحت ساترة وختم مع طلاء الأظافر عديم اللون.</li>
</ol>3-[كنفوكل] إيمونوهيستوتشيميستري
<ol><li>توجيه الفروع أن يكون الجانب ظهارة صباغ الشبكية كأس البصرية دائماً تواجه طريقة واحدة (مثلاً أعلى) للاتساق.</li>
	<li>تنفيذ التقاط الصورة إيمونوستينيد الشبكية أقسام في 63 X (التكبير عدسة الهدف) مع 2 X أو 3 X التكبير.</li>
	<li>إنشاء عدة مقاطع بصرية لكل صورة مختارة (z-مكدسات) في جميع القنوات 3 (الأحمر والأخضر والأزرق RGB) استخدام 0.35 ميكرومتر خطوة. ملاحظة: التكبير النهائي من عينة تصور في العاشر 10-20 (التكبير عدسة الهدف) سيكون 63 X، على التوالي، عندما جنبا إلى جنب مع 10x (تستخدم عادة) في عدسة العين. تصور مضغوطة مكدس البصرية لتحديد موقع إشارة 5mC و 5hmC</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

مثلايشن الحمض النووي وهيدروكسيميثيليشن هي دينامية وعكسها الحمض النووي التعديلات، التي مودولاتيثي مجموعة متنوعة من الآليات البيولوجية في دولة نامية، وكذلك كما هو الحال في الخلايا بوستميتوتيك. هنا، يمكننا وصف أسلوب استنساخه للكشف عن 5mC و 5hmC الحمض النووي إجراء تعديلات في الموقع بتقنية المناعي (باستخدام الأجسام المضادة 5mC ومكافحة--5hmC) في الأجزاء المجمدة ثابتة بارافورمالدهيد الشبكية الماوس، وتوفير المبادئ التوجيهية لتحسين وتوحيد النتائج، خاصة عند مقارنة عينات مختلفة عدة. أننا في وقت سابق تستخدم هذا الأسلوب لتحديد التغييرات 5mC في الشبكية الماوس مع استهداف الشبكية الخاصة Dnmt1و Dnmt3a و Dnmt3b الحمض النووي ميثيلترانسفيراسي الجينات، وأبلغ الاستنفاد (المتوقع) لعلامات 5mC في شبكية العين على7 .
أن الخطوة الحاسمة في الكشف المناعي 5mC هو الأمثل لعلاج أقسام نسيجية مع HCl: أقل من 15 دقيقة المعالجة المسبقة لا يتوقع أن تسفر عن نتائج استنساخه، بينما يدمر العلاج المفرط مع قائمة توافق الأجهزة النووية الهندسة المعمارية. وجدنا أفضل نتيجة بعد الاحتضان 30 دقيقة مع HCl. نوصي باستخدام دائماً HCl المخفف الطازج وحل منهاج العمل 4% تقدم طازجة للحمض النووي تمسخ والشبكية تثبيت الأنسجة.
لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها النتائج، نوصي لتشمل ثلاثة أو أربعة replicates البيولوجية حين الأمثل لإشارة 5mC. في حين تعيين كل فرد من المناعي تلطيخ قد تولد نتائج مختلفة قليلاً (مناطق heterochromatic مشرقة أكثر أو أقل)، الذي من المتوقع في توزيع المناعي النووية الأسلوب، و 5mC و 5hmC ضمن مجموعة فردية المقاطع من المتوقع أن تكون الغاية استنساخه، لطالما يتم اتباع البروتوكول.
هذا الأسلوب أيضا لديه الحد كما لاحظنا استمرار التفاوت في توزيع 5mC في نواة خلية مستقبله داخل نفس القسم. وجدنا بعض الأنوية أظهر إشارة قوية 5mC في حين أظهرت نواة الخلية المجاورة لا توجد إشارة 5mC. هذا سبب القيد في تعرية مستضد 5mC بمعاملة HCl في الأجزاء المجمدة.
أهمية هذا الأسلوب يتيح التعريب 5mC دون علاج ك الدناز وبروتيناز مما يؤدي إلى المحافظة على أفضل من تشروموسينتيرس. يعد هذا الأسلوب المتوقع للعمل بقوة على أي مقاطع من جميع الأنسجة الحيوانية الفقارية، 5mC تحمل علامات 5hmC، والمجهزة بنهج مماثل، ليس فقط الماوس الشبكية، لطالما يتم اتباع البروتوكول.

التنظيم جينية للتنمية والتوازن بوستميتوتيك الشبكية الماوس هو منطقة مثيرة للبحوث، التي وعود لتحقيق فهم رواية البيولوجية آليات التحكم في تحديد مصير ريتينوجينيسيس والخلية، الخلية نوع معين وظيفة التمثيل الغذائي، فضلا عن الأمراض المحمولة، موت الخلايا وتجديد1،2،3،4،،من56،،من78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-يخضع الكروماتين التغيرات الدينامية في التنمية، وكذلك استجابة لإشارات متغير خارجي سواء كان ذلك التأكيد، الأيض أو خلية الموت المحفزات6،،من1415، 16 , 17 , 18-في نويات الماوس، تنقسم الكروماتين euchromatin نشطة وغير نشطة heterochromatin6،،من1920. نواة الطور البيني، يتواجد يوتشروماتين في المنطقة الداخلية من النواة بينما heterochromatin خطوط على هامش النووي ونويه. هذا النمط يسمى التقليدية، وهو الغاية المصانة في حقيقيات النوى. على النقيض من ذلك، قد نوى رود في الحيوانات الليلية مثل الماوس وفار مقلوب نمط حيث تحتل النواة هيتيروتشروماتين في وسط محاط بتشكيل6،شل الأبعد18، يوتشروماتين 20. عند الولادة، وقد نوى رود الهندسة النووية التقليدية. انعكاس نويات رود يحدث أثناء التطوير قبل إعادة عرض للهندسة النووية التقليدية. أثناء هذه العملية، يفصل heterochromatin الطرفية من هامش النووي وتشروموسينتيرس تلتحم معا لنموذج تشروموسينتير واحد في المركز نواة6،18.
المجينية الحمض النووي مثلايشن تشارك في مراقبة المطابقة الكروماتين المحلية21. مثلايشن الحمض النووي يحدث في 5 ' موقف من بقايا السيتوزين دينوكليوتيديس البد أن يتم إثراء في منطقة المروج العديد من الجينات في الماوس جينومات22،،من2324،25،26 كذلك في إينتيرجينيك ومناطق إنترون، التي تحمل العناصر التنظيمية27. مثلايشن جزر البد في المروجين الدانية21،24 وتسلسل البد في الجينات القدرة على27،28 المهم في تنظيم الدولة الحيوية من الكروماتين الثنائي التكافؤ، التي تحتوي على العديد العوامل الإنمائية الجينات/النسخ تلعب دوراً هاما في التنمية والسرطان والشيخوخة29،30،،من3132،،من3334 . المشاركة ثلاثة الحمض ميثيلترانسفيراسيس (دنمتس) في مثلايشن الحمض النووي خلال الماوس التنمية35. يتم التعبير عن جميع دنمتس الثلاثة خلال الماوس التنمية الشبكية36 والتغييرات الخاصة بالشبكية في دنمت الجينات أثر التنمية الشبكية2،7. هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) هو نتاج الأكسدة ديميثيلاتيون 5-ميثيلسيتوسيني (5mC). الثلاثة الإنزيمات إزفاء (TET) أحد عشر العشر المشاركة في 5mC ديميثيليشن37،،من3839. تعديل هيدروكسيميثيل-C هو المخصب المروجين والهيئات الجينات وتسلسل الجينوم إينتيرجينيك داخل الجينات الغنية والمناطق بنشاط يدون27،40.
وهناك مجموعة متنوعة من وصف النهج لتحديد الأنماط المتغيرة مثلايشن الحمض النووي في الخلايا41،42،،من4344،،من4546، البعض منهم تمكن التحديد الكمي للتغيرات العالمية من مثلايشن الحمض النووي بينما تركز على التغييرات الدقيقة في المناطق الغنية البد داخل المروجين ومحسنات. وكانت أساليب الكشف والتحديد الكمي ل 5hmC أيضا المبلغ عنها47، بما في ذلك إيمونوهيستوتشيميستري13. تقنيات المناعي، التي تمكن من رصد التغيرات 5mC و 5hmC في نواة لتطوير قوي والخلايا بوستميتوتيك، ومفيدة للغاية لتحديد الكروماتين الديناميات في الموقع استجابة للتغيرات الخارجية أو الداخلية تؤثر على خلايا4،13،،من4849. بيد أن هذا النهج عرضه للتقليل من شأن مثلايشن الحمض النووي والتغيرات هيدروكسيميثيليشن بسبب الصعوبات التقنية، المرتبطة بالكشف عن التعديلات السيتوزين في التحضير النسيجي. وهذا يرجع إلى أن قواعد الحمض النووي نونبولار، بما في ذلك 5mC وتعديل 5hmC السيتوزين، مخفية داخل مركز الحلزون50الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، وتتطلب فضحه. هذا تنطوي على تحديات خاصة في التحضير النسيجي المجمدة، التي قد تفقد بسرعة منظمة إعلامية من الأنسجة الأصلية عندما يتم تطبيق معاملة قاسية.
الشبكية الماوس نموذج ممتاز تشريح مساهمة مثلايشن الحمض النووي للتنمية العصبية والتوازن بوستميتوتيك. لا يوجد سوى 6 أنواع من الخلايا العصبية (فوتوريسيبتورس رود والمخروط، أماكريني، القطبين، خلايا العقدة وأفقي)، نوع واحد من الخلايا الدبقية (إطلاق مولر) وواحد نيوروبيثيليال الخلية النوع (ظهارة صباغ الشبكية)51. وأبلغ أنواع الخلايا الشبكية أنماط متميزة من الحمض النووي مثلايشن18،19، التي درست مؤخرا في قرار واحد-قاعدة1،5،9،12. ونحن مؤخرا ذكرت التطبيق إيمونوهيستوتشيميستري لتحديد نمط التوزيع داخل نواة خلايا الشبكية وتغيرات في نواة الشبكية الماوس الكبار، حيث تم إزالة جميع ميثيلترانسفيراسيس الحمض النووي الثلاثة باستهداف الشرطي 5mC 7-مقارنة بعدد من التقارير، حيث وجود مثلايشن الحمض النووي في خلايا الشبكية ويمكن اعتبار فقط إيجابية أو إشارة سلبية في هايبرميثيلاتيد الخلايا المبرمج تمر، تمكين النهج الذي نتبعه كشف الكروماتين محددة الترتيب داخل نواة الخلية الشبكية، التي نحن والعديد من المجموعات ذكرت ونوقش في وقت سابق5،،من67،18،،من1936 , 52-وهنا، يمكننا وصف تقنية المناعي (المدينة) للكشف عن 5mC و 5hmC في المجمدة مقاطع نسيجية بارافورمالدهيد--الثابتة في التفاصيل، فضلا عن إثبات البيانات التي كنا قادرين على إنتاج من تقريرنا الأصلي7 .

<table><tbody><tr><td><قوي>الإمدادات</قوي>29G1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>/2 فائق الدقة</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>مقص العيون</td><td>أدوات العلوم الجميلة ، Inc. &nbsp ؛</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>قلم PAP</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscope Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>السكروز</td><td>سيجما</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek مركب القطع البصري (OCT) VWR</td><td></td> <td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR تحليلي &nbsp ؛</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl درجة الحموضة 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>مصل الماعز</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>Active Motif</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>إطالة الذهب المضاد للتلاشي المتوسط</td><td>الحرارية فيشر العلمي</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td><قوي> المعدات< / قوي></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>مجهر متحد البؤر</td><td>زايس</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

الكشف المناعي 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في تطوير والشبكية الماوس بوستميتوتيك

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

التخلق للتنمية الشبكية هو حقل بحث مدروسة، التي تبشر بتحقيق مستوى جديد من التفاهم حول الآليات لمجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية الشبكية البشرية وتحديد نهج معاملة جديدة. يتم تنظيم بنية الشبكية الماوس النووية في نمطين من أنماط مختلفة: التقليدية ومقلوب. النمط التقليدي عالمي حيث heterochromatin مترجمة على هامش النواة، بينما يقيم euchromatin النشطة في الداخلية النووية. على النقيض من ذلك، النمط النووي المقلوب فريدة من نوعها لنواة خلية مستقبله قضيب البالغين heterochromatin يموضع للمركز النووي، حيث يوتشروماتين يتواجد في محيط النووية. ويلاحظ مثلايشن الحمض النووي أساسا في تشروموسينتيرس. مثلايشن الحمض النووي تعديل التساهمية دينامية على بقايا السيتوزين (5-ميثيلسيتوسيني، 5mC) من دينوكليوتيديس البد أن تكون أثرت في مناطق المروج العديد من الجينات. ثلاثة ميثيلترانسفيراسيس الحمض النووي (DNMT1 و DNMT3A و DNMT3B) المشاركة في مثلايشن الحمض النووي من خلال التنمية. الكشف عن 5mC مع تقنيات المناعي صعبة للغاية، الإسهام في التفاوت في النتائج، كما يتم إخفاء جميع قواعد الحمض النووي بما في ذلك قواعد 5mC تعديل داخل الحلزون الدنا مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل. ترسيم تفصيلية لتوزيع 5mC أثناء التطوير غير مفيدة للغاية. هنا، يمكننا وصف أسلوب استنساخه للكشف المناعي قوي 5mC وأخرى جينية الحمض النووي علامة 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، الذي كولوكاليزيس مع الكروماتين "فتح"، ترانسكريبتيونالي النشطة في تطوير و الماوس بوستميتوتيك الشبكية.

لتحديد توزيع 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) و 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) أثناء التنمية الشبكية وفي شبكية العين بوستميتوتيك، ونحن إيمونوستاينيد C57BL/6J الماوس الشبكية قسم من E16 و P15 و P0 P90 مع الأجسام المضادة المحددة إلى 5mC و 5hmC.
في E16 تلطيخ 5mC كان قويا في تشروموسينتيرس نواة الخلية بينما تلطيخ ضعيفا ولوحظ في نواة خلية كاملة (الشكل 1a). 5hmC تلطيخ مقتصرة على نواة الخلية وكان غائبا من تشروموسينتيرس (الشكل 1b).
في P0 الشبكية، وكان المترجمة إشارة 5mC إلى تشروموسينتيرس من نواة الخلية وهامش النووي (الشكل 2aوالسهم ورأس السهم). كما لاحظنا تلطيخ ضعيفة من 5mC بين تشروموسينتيرس نواة الخلية. إشارة 5hmC كان حاضرا بقوة في نواة الخلية باستثناء تشروموسينتيرس (الشكل 2). وجدنا أنوية أكثر ملطخة ب 5mC و 5hmC في طبقة نيوروبلاست الداخلية (إينبل) (الشكل 2 ج، الخط المنقط)
في P15 الشبكية، وجدنا تلطيخ قوية 5mC و 5hmC في الطبقة الخارجية النووية (ONL) والطبقة النووية الداخلية (المكتب) وطبقة خلايا العقدة (جكل) (الشكل 3). في ONL (فوتوريسيبتورس رود)، كانت إشارة 5mC موجودة في تشروموسينتيرس لنواة الخلية وهامش النووي (الأرقام 3a-3 ج، والجيل الثالث 3g). تم العثور على إشارة 5hmC في نواة خلية كاملة باستثناء تشروموسينتيرس (الأرقام 3d-3f). مجهر إلكتروني على الشبكية P15 يبين التوزيع للمجالات هيتيروتشروماتيك في نواة الخلية رود مشابهة لتلك الموجودة مع إشارة جسم 5mC (ح 3 أرقام و 3i).
تلطيخ 5mC في المكتب وجكل قوية في تشروموسينتيرس نواة الخلية وتلطيخ ضعيفة وقد لوحظ أيضا في نواة خلية كاملة (الأرقام 3j-3 لتر و 3r-3t). خلافا 5mC، وكان المترجمة إشارة 5hmC إلى نواة الخلية كلها باستثناء تشروموسينتيرس في المكتب وجكل (الأرقام م 3-3o و 3 وات 3u). لاحظنا قوية إشارة 5hmC على هامش جكل نواة الخلية.
في فوتوريسيبتورس رود الكبار، اقتصر إشارة 5mC تشروموسينتير وهامش النووي لنواة الخلية (الأرقام 4a-4 ج) بينما يقتصر إشارة 5hmc على هامش النووي (د 4 أرقام-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> الشكل 1. ترجمة 5-ميثيلسيتوسيني و 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني في الشبكية الماوس في الجنينية يوم 16. إيمونوستينينج C57BL/6J الشبكية مع الأجسام المضادة إلى 5mC (الأحمر، أ) و 5hmC (الخضراء، ب). في E16، 5mC إشارة قوية جداً في تشروموسينتيرس نواة الخلية وأيضا موجودة في نواة خلية كاملة في مستوى أدنى بكثير. تلطيخ 5hmC يقتصر حصرا على نواة الخلية. ويمثل الفريق ج 5mC المدمجة والصورة 5hmC. هي نواة كونتيرستينيد مع DAPI (الأزرق، ج). وتمثل insets تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصور. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> الرقم 2. المناعي تلطيخ 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في الشبكية الماوس في يوم الولادة 0. إيمونولابيلينج C57BL/6J الشبكية مع الأجسام المضادة إلى 5mC (الأحمر، أ) و 5hmC (الخضراء، ب). في P0 الشبكية، 5mC و 5hmC موجودة في طبقة نيوروبلاست الخارجي (أونبل) وطبقة نيوروبلاست الداخلية (إينبل). أ) إشارة 5mC موجود بقوة في تشروموسينتيرس (سهم) وهامش النووي لنواة الخلية (رأس السهم). ويلاحظ أيضا تلطيخ ضعيفة من 5mC ما بين تشروموسينتيرس نواة الخلية. ب) تلطيخ 5hmC يقتصر على نواة الخلية، ويلاحظ إشارة قوية في إينبل (الخط المنقط في لوحة ج). ويمثل الفريق ج 5mC المدمجة والصورة 5hmC. هي نواة كونتيرستينيد مع DAPI (الأزرق، ج). وتمثل insets تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصور. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> الشكل 3. 5-ميثيلسيتوسيني 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني التوزيع وفي الشبكية الماوس عند الولادة يوم 15. إيمونوستينينج C57BL/6J الشبكية مع الأجسام المضادة--5mC و 5hmC (-ز، ي ص). في الطبقة الخارجية النووية (ONL) (فوتوريسيبتورس رود)، إشارة 5mC (أ) عادة ما يتزامن مع تشروموسينتيرس نواة الخلية (رأس السهم، ب) الأحمر، وأيضا يموضع على هامش النووي (سهم، ب). لوحة ب (أحمر) وجيم (رمادي) تمثل تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصورة. إشارة 5hmC (الخضراء، د) تقتصر على نواة خلية كاملة باستثناء تشروموسينتيرس. ه الفريق (الأخضر) و (الرمادي) و تمثل تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في دال صورة لوحة تمثل ز 5mC المدمجة والصورة 5hmC. هي نواة كونتيرستاينيد مع DAPI. لوحة ح، وانتقال المجهر الإلكتروني صورة نويات مستقبله في يوم الولادة 15 تبين توزيع المجالات هيتيروتشروماتيك. السهم الأسود في ح الفريق يشير إلى قضيب واحد مستقبله نواة توسيعه في الفريق الأول-رؤوس الأسهم الحمراء في لوحة وأشير إلى مجالات heterochromatic داخل نواة مستقبله رود بينما الأسهم الحمراء تشير إلى هيتيروتشروماتين في محيط النووية. في المكتب (ي-س) ونواة الخلية جكل (ص ص)، إشارة 5mC (أحمر) هو مترجم إلى تشروموسينتيرس الموجودة في المحيط وتلطيخ ضعف الكشف عن كما في بقية نواة الخلية. لوحة ك (أحمر) وأنا (رمادي) تمثل تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في ي الصورة. (الأخضر) تلطيخ 5hmC في نواة الخلية المكتب وجكل تقتصر على نواة الخلية كلها. ملاحظة تلطيخ 5hmC قوية في محيط الخلايا جكل النووية. ف الفريق و x تمثل 5mC المدمجة والصورة 5hmC بينما تمثل لوحة س وص تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصورة ف والعاشر على التوالي. هي نواة كونتيرستينيد مع DAPI. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> الشكل 4. 5-ميثيلسيتوسيني 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني التوزيع وفي نويات مستقبله رود C57BL/6J الماوس الشبكية في يوم الولادة 90. تلطيخ 5mC (أحمر،) موجود بقوة في تشروموسينتير في نواة الخلية وأيضا الحاضر ضعيفة في محيط النووية. لوحة ب (أحمر) وجيم (رمادي) تمثل تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصورة. تلطيخ 5hmC (الخضراء، د) يقتصر حصرا على هامش النووي ه الفريق (الأخضر)، والتكبير و (رمادي) تمثل منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في دال صورة الفريق يمثل ز 5mC المدمجة والصورة 5hmC مع الفريق ح التكبير للمنطقة التي تظهر مع النجمة في الصورة هي كونتيرستاينيد نوى زاي مع DAPI (أزرق). شريط الحجم: 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

والهدف من هذا التقرير وصف البروتوكول للكشف المناعي قوية من علامات جينية، 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) و 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) في تطوير وبوستميتوتيك الماوس الشبكية.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مثيلة الحمض النووي ، مثل التغيرات في الكروماتين أثناء نمو الشبكية في شبكية العين بعد الانقسام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها بقوة على أي أقسام من جميع أنسجة شبكية العين الفئرانية التي تحمل توزيع 5-ميثيل سيتوزين ، 5-هيدروكسي ميثيل سيتوزين التي تتم معالجتها في نهج مماثل. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات تحضير الأنسجة وتلوينها ، لأنه إذا تم استخدام الاستعدادات النسيجية المجمدة ، فقد تفقد الأنسجة التنظيمية والأصلية القيمة.سيوضح بقية الإجراء بابلو دياز ، باحث مشارك من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء ، استخدم إبرة قياس 29 بوصة نصف بوصة لثقب عيني فأر مقطوع الرأس على الجانب الظهري للعينين. للحصول على أكواب العين ، قم باستئصال العينين على الفور عن طريق قطع الصلبة بمقص عيون ناعم لإزالة القرنية والعدسة.ثبت أكواب العين و E16 العيون الكاملة في 4٪ بارافورمالدهيد أو PFA في 1xPBS درجة الحموضة 8.0 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسلها مرتين في مليلتر واحد من 1xPBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. لحماية أكواب العين والعينين الكاملة بالتبريد ، احتضنها في 1xPBS درجة حموضة 8.0 مع 10٪ سكروز في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.ثم في 20٪ سكروز في 1xPBS لمدة ساعة واحدة. وأخيرا في 30٪ سكروز في 1xPBS عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بتضمين أكواب العين والعينين في مركب درجة حرارة القطع الأمثل ، أو OCT ، في قوالب التبريد.ثم قم بتجميدها في حمام الإيثانول الثلجي الجاف واحتفظ بها عند 80 درجة مئوية. قبل البدء في التقطيع بالتبريد ، قم بإزالة القوالب باستخدام أكواب العين والعينين المدمجة من 80 درجة مئوية. ضعها في حامل ناظم البرد واتركها تتوازن إلى 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.باستخدام ناظم البرد عند 20 درجة مئوية ، قم بقص المقاطع العرضية للشبكية بسمك 12 ميكرومتر بالتوازي مع المحور الصدغي من خلال رأس العصب البصري. قم بتركيب الأقسام على شرائح المجهر وتخزينها على حرارة 80 درجة مئوية. لبدء التلوين المناعي ، استخدم قلما حاجزا مسعورا لتطويق أقسام الشبكية المثبتة على الشرائح.اغسل الأقسام مرة واحدة ب 200 ميكرولتر من 1xPBS لمدة 10 دقائق. تخلل الأقسام ب 200 ميكرولتر من PBST لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتغيير طبيعتها ب 200 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك العادي الطازج المصنوع بعناية في 1xPBS لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتحسين إشارة 5 مللي متر مكعب.بعد التمسخ ، أضف 100 ميكرولتر من 0.1 Tris-HCl pH 8.3 على أقسام الشبكية ، واحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحييدها. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول الحظر. واحتضان الأقسام في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.أضف الأجسام المضادة المناسبة ، المخففة من واحد إلى 500 في محلول مانع ، إلى الأقسام واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الأقسام ثلاث مرات لمدة 10 إلى 15 دقيقة لكل منها بنسبة 0.1٪ PBST. أضف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المخففة من واحد إلى 1000 في محلول مانع يحتوي على محلول DAPI في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.بعد ذلك ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من 0.1٪ PBST لمدة 10 دقائق لكل منها. بعد الغسيل الأخير ، أضف وسط تركيب مائي. غطيها بغطاء.ثم تابع الفحص المجهري متحد البؤر. بعد تلطيخ الشبكية المناعي في E16 ، كانت إشارة 5mC قوية في المراكز الكروموسية لنوى الخلية وموجودة عند مستوى أقل بكثير في نوى الخلية بأكملها. تم العثور على تلطيخ 5hmC حصريا في نوى الخلية وغائب عن مراكز الكروموس.في شبكية العين P0 ، كانت كل من إشارات 5mC و 5hmC موجودة في طبقة الخلايا العصبية الخارجية ، وطبقة الخلايا العصبية الداخلية. كانت إشارة 5mC قوية في مراكز اللونات والمحيط النووي لنوى الخلية ، وأضعف بين المراكز الكروموسية لنوى الخلية. اقتصر تلطيخ 5 hmC على نواة الخلية.في شبكية العين P15 ، في الطبقة النووية الخارجية ، تم اكتشاف إشارة 5mC في المراكز الكروموسية لنوى الخلية والمحيط النووي. في حين أن إشارة 5hmC كانت في نوى الخلية بأكملها باستثناء مراكز الكروموس. في الطبقة النووية الداخلية وطبقة الخلايا العقدية ، كانت إشارة 5mC قوية في مراكز الكروموكورات لنوى الخلية ، وضعيفة في نوى الخلية بأكملها.بينما تم العثور على إشارة 5hmC في نوى الخلية بأكملها باستثناء مراكز الكروموس. في المستقبلات الضوئية للقضبان البالغة ، اقتصرت إشارة 5mC على مركز اللونوم والمحيط النووي ، بينما اقتصرت إشارة 5hmC على المحيط النووي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر علاج الأقسام النسيجية بالتعرض الأمثل ل HCl ، وهو 30 دقيقة.إذا كان التعرض أقل أو أكثر ، فلا يمكن تكرار النتائج المثلى. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط ، وقياس الطيف الكتلي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل القياس الكمي للتغيرات في قياس 5-ميثيل سيتوزين و 5-هيدروكسي ميثيل سيتوزين. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التطور العصبي لاستكشاف التغيرات اللاجينية في الكروماتين.لا تنس أن العمل مع حمض الهيدروكلوريك و PFA يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل التخلص السليم ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

immunohistochemical-detection-5-methylcytosine-5

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

يمكن استخدام EpiMark 5 - 5 - مؤسسة حمد الطبية وأدوات التحليل MC لتحليل وquantitate methylcytosine 5 و 5 hydroxymethylcytosine داخل موضعا cific جمعية مهندسي البترول. عدة يميز MC - 5 - 5 من مؤسسة حمد الطبية عن طريق إضافة السكر إلى مجموعة الهيدروكسيل من HMC - 5 عبر رد فعل الأنزيمية باستخدام β - ناقلة الغلوكوزيل (T4 - BGT). عند 5 - HMC يحدث في سياق CCGG ، يحول هذا التعديل MspI شطورة موقع إلى موقع غير شطورة.

الحساسية العالية 5 - hydroxymethylcytosine كشفها في أنسجة المخ BALB / C

ووصف هو عملية وضع العلامات على مرحلتين باستخدام β-ناقلة الغلوكوزيل (β-GT) لنقل أزيد من الغلوكوز لمؤسسة حمد الطبية-5، تليها الكيمياء اضغط هنا لرابط نقل البيوتين لتخصيب سهلة وكثافة مستقلة. هذه الطريقة فعالة ووضع العلامات المحددة تمكن من مؤسسة حمد الطبية تخصيب-5 مع خلفية منخفضة للغاية وعالية الإنتاجية عن طريق رسم الخرائط epigenomic الجيل القادم التسلسل.

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

يصف هذا الفيديو تقنية اللطخة النقطية لتحديد مستوى مثيلة الحمض النووي في الخلايا الغضروفية البشرية في المختبر عن طريق نشاف عينات الحمض النووي على غشاء النايلون والتصور اللاحق باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. هذا يساعد على تحديد النمط الظاهري للخلايا الغضروفية في مراحل مختلفة من الثقافة.

5-ميثيل سيتوزين نقطة لطخة لتحديد مدى مثيلة الحمض النووي

يوفر شبكية العين الفئران حديثي الولادة نموذجا الفسيولوجية تتميز كذلك من الأوعية الدموية، والذي يسمح التحقيقات عن دور الجينات المختلفة أو الأدوية التي تعدل الأوعية الدموية...

كله جبل تلوين مناعي للشبكية الفأر حديثي الولادة المعنية بالتحقيق في الأوعية الدموية<em&gt; في الجسم الحي</em

العصبية السلف الانقسام هو معلمة الحرجة من تكوين الخلايا العصبية. ويستند جزء كبير من فهمنا لالعصبية السلف الانقسام على تحليل الأنسجة الثابتة. تصوير حي في شرائح المخ الجنينية هي تقنية متعددة لتقييم الانقسام مع القرار الزماني والمكاني عالية في بيئة تسيطر عليها.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

تسلسل أمبليكون ثنائي الكبريت (BSAS) هو طريقة لقياس مثيلة السيتوزين في المناطق الجينومية المستهدفة ذات الأهمية. تستخدم هذه الطريقة تحويل ثنائي الكبريتيت مقترنا بتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للمناطق المستهدفة قبل تسلسل الجيل التالي لإنتاج الكمية المطلقة لمثيلة الحمض النووي على مستوى أساسي محدد.

استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

هنا نصف طريقة كيميائية مناعية حساسة لرسم خرائط التوزيع المكاني لمشتقات أكسدة 5 مللي متر مكعب بناء على استخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع البيروكسيداز وتضخيم إشارة التيراميد.

الكشف عن أشكال معدلة من السيتوزين عن طريق الحساسة المناعية

المكتشفة حديثا المؤكسد أشكال 5-ميثيلسيتوسيني (أوكسي-mCs)، 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيلسيتوسيني (5caC) قد تمثل تعديلات الحمض النووي متميزة مع أدوار وظيفية فريدة من نوعها. هنا هو وصف سير عمل شبه كمي للتصور oxi-الإشراف على التوزيع المكاني والتنميط كثافة إشارة كولوكاليزيشن.

إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا وأنسجة الدماغ، وذلك باستخدام تلطيخ الفلورة المناعية وطرق الحمض النووي نقطة لطخة.

الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران

تصف هذه الورقة بروتوكولا للمراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين الطبيعية والشاذة داخل أجنة الزرد السليمة.

المراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين الطبيعية والشاذة داخل أجنة الزرد السليمة

يتم وصف بروتوكول لإعداد استئصال شبكية الفئران بالتبريد وإجراء التلوين المناعي على المستقبلات الضوئية. تمكن هذه المقالة الباحثين من إنتاج أقسام مجمدة لشبكية العين باستمرار مع مورفولوجيا محفوظة جيدا ونتائج تلطيخ مناعي عالية الجودة.

التشريح بالتبريد والتلوين المناعي لشبكية العين في الفأر

اكتشف بروتوكول الكشف المناعي لعلامات 5mC و5hmC الإيبيجينية في شبكية الفأر أثناء التطور. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة تغيرات الكروماتين في الأنسجة العصبية بعد الانقسام.

الكشف المناعي 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في تطوير والشبكية الماوس بوستميتوتيك

استكشف المزيد من الفيديوهات