المشبك قوة رهيوميتري لوصف الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تستخدم PID ، وهو نظام مشتق متكامل نسبي لتطبيق بروتوكولات القوة الخاضعة للرقابة على عينات هيدروجيل البروتين ، ويستخدم حجم عينة صغير. تسمح بروتوكولات مشبك القوى بالتفسير المباشر للبيانات بينما تعد الأحجام المنخفضة أمرا بالغ الأهمية عند العمل بجد لإنتاج البروتينات المتوفرة بكميات صغيرة فقط. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تطوير وتوصيف مواد بيومترية جديدة ذات مرونة دائمة ، باستخدام خاصية الانتقال القابلة للطي وإعادة الطي للبروتينات.

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة في ميكانيكا الأنسجة والمواد الحيوية من خلال تمكين قياسات مليارات جزيئات البروتين في سحب واحد ومحاكاة البيئات المزدحمة الخاصة بالأنسجة البيولوجية. ابدأ هذا الإجراء بإعداد حلول الكاشف كما هو موضح في بروتوكول النص. لتصنيع الهيدروجيل القائم على البروتين ، قم أولا بتثبيت إبرة قياس 23 على حقنة سعة ملليلتر واحد باستخدام مكبس مضغوط.

بعد ذلك ، قم بقطع أنبوب بولي تترافلورو إيثيلين بطول 10 سم ، أو PTFE ، باستخدام شفرة حلاقة. قم بتوصيل الإبرة والحقنة بأحد طرفي أنبوب PTFE. أدخل الطرف الثاني من الأنبوب في محلول سيلان واملأ الأنبوب عن طريق سحب مكبس المحقنة.

اترك الأنبوب لمدة 30 دقيقة تقريبا. ثم قم بإزالة محلول السيلان وجفف الأنبوب بالهواء المضغوط. الآن ، امزج محلول البروتين مع APS و Tris (bipyridine) الروثينيوم (II) كلوريد في أنبوب 1.5 مل باستخدام نسبة حجم ثابتة.

دوامة المحلول النشط ضوئيا حتى يمتزج تماما. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمزيج بأقصى سرعة لإزالة أي فقاعات من المحلول. يمكن أن تتشكل الفقاعات أثناء تحميل مزيج الهيدروجيل الضوئي النشط في أنبوب التفلون ، مما يؤدي إلى تلف العينة.

لمنع تكوين الفقاعات ، احتفظ بنهاية أنبوب التفلون في مزيج المحلول أثناء عملية التحميل وسحب مكبس المحقنة ببطء. أدخل الطرف المفتوح لأنبوب PTFE المعالج في الخليط الضوئي واسحب المحلول في الأنبوب عن طريق سحب مكبس المحقنة. الآن ، ضع الأنبوب المحمل على بعد حوالي 10 سم من مصباح زئبق بقوة 100 واط لمنع تسخينه والاحتفاظ به لمدة تصل إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة الأنبوب من الإبرة وقطع حواف الأنبوب بالقرب من نهايات الهيدروجيل بشفرة حلاقة. بعد ذلك ، استخدم إبرة ضعيفة عيار 24 لبثق الهيدروجيل في محلول Tris. افحص المواد الهلامية بصريا بحثا عن أي عيوب قد تتشكل أثناء البثق أو بسبب الفقاعات وتخلص من أي مواد هلامية معيبة.

ابدأ برنامج التحكم في الجهاز وقم بتشغيل محرك الملف الصوتي. ثم اضبط موضع الملف على قيمة في نهاية النطاق. قم بإزاحة الخطافات في الاتجاه Z وقم بمحاذاة المنعطف في الاتجاه X.

بعد ذلك ، سجل قيم مسامير الميكرومتر للاتجاه X. الآن ، اربط عقدة مزدوجة فضفاضة في نهاية خيط الخياطة ، بحيث يبلغ قطر الحلقة حوالي أربعة ملليمترات. ثم اقطع الحلقة من الشريط.

كرر لتشكيل حلقة ثانية. ثم ضع الحلقتين على الخطاف المتصل بمستشعر القوة. املأ الغرفة التجريبية بمحلول Tris وانقل عينة الهيدروجيل إلى الغرفة المملوءة باستخدام ملاقط طبية.

ضع خطافات مستشعر الملف الصوتي والقوة بالقرب من سطح المحلول وقم بمحاذاة الخطافات في جميع الاتجاهات مع معالجات تحديد المواقع XYZ. باستخدام ملاقط طبية ، قم بتعليق جانبي عينة هيدروجيل البروتين على الخطافات المتصلة بالملف الصوتي ومستشعر القوة. الخطأ النموذجي هو الإفراط في شد حلقات الخياطة حول عينات الهيدروجيل أثناء عملية التعلق.

قد يؤدي هذا إلى تكوين شق وقطع عينة الهيدروجيل. شد حلقة خياطة واحدة بعناية حول عينة الهيدروجيل على خطاف الملف الصوتي عن طريق إمساك طرفي حلقة الخياطة بالملاقط الطبية وسحبها في وقت واحد. كرر هذه الخطوة للحلقة المتصلة بمستشعر القوة.

شد حلقات الخياطة على انحناءات كل خطاف لمنع أي انزلاق. استخدم هذه الانحناءات كنقاط مرجعية لإيجاد الفصل الصفري بين الخطافات. قطع الأطوال الزائدة للخيوط باستخدام مقص طبي.

حرك الهيدروجيل المرفق باستخدام معالجات Z على طول المحور Z باتجاه الغرفة التجريبية لغمر الهيدروجيل في المحلول التجريبي. قم بمحاذاة عينة الهيدروجيل في YZ باستخدام المتلاعبين بحيث لا يتعرض الجل لأي ضغط. قم بتصفير مستشعر القوة وافصل الخطافين باستخدام مراحل X ميكرومتر حتى يبدأ الجل في تجربة القوة.

بمجرد حدوث ذلك ، قم بإعادة المسمار اللولبي للميكرومتر قليلا في الاتجاه X. سجل موضع كل من المتلاعبين لمحرك الملف الصوتي والمستشعر. بعد ذلك ، استخدم الفرق بين هذه القيم وتلك التي تم قياسها مسبقا لحساب الفصل الدقيق بين خطافات الربط في بداية التجربة.

لأداء دورة منحدر القوة عن طريق زيادة القوة بمعدل التحميل المطلوب ، أدخل قيم القوة الأولية والنهائية ، بالإضافة إلى مدة البروتوكول ، والتي تظهر على شكل حرف V مقلوب ، متبوعة بقوة منخفضة ثابتة لمدة 200 ثانية تقريبا للسماح لمجالات البروتين بإعادة الظهور قبل الدورة التالية. قم بإجراء بروتوكول قوة ثابتة عن طريق تطبيق قوة منخفضة لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، قم بزيادة القوة إلى قوة ثابتة لفترة زمنية محددة ، متبوعة بإخماد القوة مرة أخرى إلى نفس القيمة المنخفضة لأكثر من 300 ثانية للسماح لمجالات البروتين بالانعومة واستعادة مرونة الهلام.

أخيرا ، قم بإجراء تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. يبدأ كل قياس بمنحنى الركود. من خلال تركيب سطرين ، يتم تحديد القوة الصفرية على المستشعر وطول الهلام الحقيقي.

يتم حساب طول الجل الحقيقي من تقاطع النوبات وموضع مسامير الميكرومتر. يمكن لنظام قياس الريومتر بقوة المشبك تطبيق نوعين مختلفين من البروتوكولات. في وضع منحدر القوة ، تتعرض عينة الهيدروجيل لبروتوكول تغيير القوة مع مرور الوقت يشبه وضع القوة الثابتة V.In المقلوب ، ويتغير الضغط المطبق في نمط يشبه الخطوة.

أثناء القياسات ، يقوم نظام PID بضبط امتداد الهيدروجيل عن طريق تغيير موضع الملف لمتابعة نقطة الضبط المحددة مسبقا من بروتوكول القوة. ثم يتم حساب الإجهاد بقسمة الامتداد المقاس إلى طول الهلام الحقيقي. يتم تحديد الإجهاد بقسمة القوة المطبقة على مساحة المقطع العرضي لعينة الهيدروجيل.

الأفضل تمثيل آثار منحدر القوة على أنها الإجهاد مقابل الإجهاد. يمكن حساب معامل يونغ من مقياس المنحدر أثناء مرحلة التحميل. يعطي التباطؤ تبديد الطاقة الناتج عن فتح البروتين وإعادة طيه.

من الأفضل تمثيل آثار القوة الثابتة كدالة للوقت. يمكن استخدام التغيير في الإجهاد لقياس معدلات الفتح وإعادة الطي عن طريق تركيب أسي مزدوج. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجفيف أي سيلان من الأنبوب قبل إضافة البروتين ، والطرد المركزي لمزيج البروتين لإزالة الفقاعات ، وفحص الفقاعات بعد حقن مزيج البروتين داخل الأنبوب والتخلص من أي هلاميات مائية تالفة ميكانيكيا بعد البثق من الأنبوب.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة في البداية من أجل ربط المواد الهلامية بالخطافات باستخدام الغرز الجراحية دون التسبب في تلف عينة الهيدروجيل. يمكن أن يؤدي بثق الجل من الأنبوب إلى إتلاف الهيدروجيل أيضا. تتيح هذه الطريقة تطبيق بروتوكولات القوة الثابتة على عينات الهيدروجيل منخفضة الحجم.

تسمح هذه التجارب بفصل السلوكيات المرنة واللزجة المرنة ودراسة ميكانيكا البروتين التي تتكشف والطي في نهج جماعي. بعد تطويرها ، تسمح هذه التقنية للباحثين في مجال علوم المواد باستكشاف مواد حيوية لينة جديدة مثل الهلاميات المائية القائمة على البروتينات المتعددة التي لديها إمكانات ممتازة للعمل كسقالات هندسة الأنسجة وأنظمة توصيل الأدوية والحبر البيولوجي للطباعة ثلاثية الأبعاد. لا توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لآليات الهلاميات المائية القائمة على البروتين فحسب ، بل يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل قياس الاستجابة متساوية القياس لألياف العضلات أو مرونة الأنسجة مثل الجلد.