تعديل ناقلات التعبير باكولوفيروس لإنتاج يفرز البروتينات النباتية في خلايا الحشرات

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الهيكلية للبروتينات المفرزة ، مثل تحديد بنية البروتين ، عن طريق علم البلورات و cryo-EM. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنتج كمية كبيرة من البروتينات المفرزة المؤتلفة بتكلفة منخفضة نسبيا لتحديد بنية البروتين. أولا ، قم بتجميع جزء من الحمض النووي يحتوي على موقع قطع BglII خماسي الرئيسيين ، وهو تسلسل إشارة الإفراز ذي الأهمية في موقع الاستنساخ المتعدد كما هو موضح في بروتوكول النص.

بعد ذلك ، قم بهضم أربعة ميكروغرامات من الحمض النووي مع BglII و X1 ، وأربعة ميكروغرامات من الحمض النووي المتجه للتعبير مع BamH1 و X1. امزج 10 وحدات من كل إنزيم تقييد مع الحمض النووي في مخزن مؤقت لتفاعل التركيز 1X. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. أضف 10 ميكرولترات من خليط تفاعل الربط الذي يحتوي على 1X T4 DNA Ligase Interaction المؤقت وخمس وحدات من T4 DNA Ligase إلى أنبوب Eppendorf جديد سعة 1.5 مل.

ثم أضف 100 نانوجرام من الحمض النووي المتجه الخطي و 400 نانوجرام من جزء الحمض النووي المهضوم. احتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. قم بتحويل خمسة ميكرولترات من خليط الربط إلى 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة ب DH5 ألفا وحدد المستعمرات الناتجة على لوحة أجار Ampicillin LB كما هو موضح في بروتوكول النص.

اختر ما بين خمس و 10 مستعمرات تنقل كل منها إلى ملليلترين من وسط LB يحتوي على 100 ميكروغرام لكل مليلتر أمبيسلين. قم بزراعة هذه المستعمرات في حاضنة اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. بعد ذلك ، استخدم مجموعة DNA Miniprep لاستخراج كل حمض نووي بلازميد.

قم بتأكيد المستنسخة عن طريق تسلسل الحمض النووي باستخدام تمهيدي تسلسل أمامي كما هو موضح في بروتوكول النص. باستخدام 100 نانوجرام من البلازميد المبني ، قم بتحويل 40 ميكرولترا من الخلايا المختصة DH10Bac كما هو موضح في بروتوكول النص. احتضان ألواح التحويل عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

التقط مستعمرتين أبيضتين من كل لوحة تحويل وقم بتلقيح كل مستعمرة في ملليلترين من وسط LB الذي يحتوي على الكاناميسين والجنتاميسين والتتراسيكلين. استخراج الحمض النووي الباكميد والتحقق منه كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتقسيم كل حمض نووي إلى أنبوبين مع نقل 20 ميكرولترا إلى كل أنبوب.

ثم قم بتخزين الأنابيب عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للمتابعة. يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة بشكل معقم. في صفيحة من ستة آبار ، قم بزراعة طبقة أحادية من خلايا Sf9 في وسط الاستزراع مع مصل بقري للجنين بنسبة 10٪ ، و 100 ميكروغرام لكل مليلتر من المضادات الحيوية البنسلين والستربتومايسين عند التقاء 27 درجة مئوية إلى 80٪.

لكل تعداء ، أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا Sf9 غير المكملة بدون مضادات حيوية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر. قم بتخفيف 20 ميكرولترا من الحمض النووي الباكميد في كل أنبوب وقم بنقره برفق للخلط. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا Sf9 غير المكملة بدون مضادات حيوية إلى أنبوب 1.5 مليلتر لكل تعداد.

بتخفيف ثمانية ميكرولترات من كاشف تعداء الدهون في كل أنبوب ، واخلطه عن طريق سحب العينات جيدا لأعلى ولأسفل ست مرات. امزج بين هذين المحلولين واخلطهما عن طريق سحب العينة ببطء لأعلى ولأسفل ثلاث مرات. احتضن لمدة 20 إلى 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل كل بئر من لوحة الثقافة مرتين باستخدام ثلاثة ملليلتر من وسط ثقافة Sf9 غير المكملة بدون مضادات حيوية لكل غسلة. بعد ذلك ، أضف 0.8 مل من وسط زراعة الخلايا Sf9 غير المكمل بدون مضادات حيوية إلى كل أنبوب يحتوي على خليط الحمض النووي الدهني. قم بسحب الأنبوب ببطء لأعلى ولأسفل ثلاث مرات للخلط.

قم بشفط وسائط الغسيل من الألواح ، وتراكب العينات بخليط التعداد. احتضان الصفيحة المنقولة لمدة خمس ساعات عند 27 درجة مئوية. بعد ذلك ، استبدل وسائط التعدي بوسط زراعة الخلايا Sf9 الكامل الذي يحتوي على 10٪ FBS ، و 100 ميكروغرام لكل مليلتر من المضادات الحيوية البنسلين - الستربتومايسين.

احتضان عند 27 درجة مئوية لمدة أربعة أيام. ثم اجمع المادة الطافية في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل. تدور في 1 ، 010 مرات جم لمدة خمس دقائق لإزالة بقايا الخلية.

تخلص من الحبيبات ، وصب المادة الطافية في أنبوب نظيف. يحفظ على حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى عام أو حتى يصبح جاهزا للاستخدام. لتضخيم كل فيروس مؤتلف ، قم أولا بزراعة طبقة أحادية من خلايا Sf9 على صفيحة 150 ملم إلى 80٪ التقاء.

ثم استنشق الوسط ، وأضف ملليلترين من فيروس P0 إلى كل بئر. احتضن لمدة ساعة واحدة في حاضنة 27 درجة مئوية ، وهز اللوحة كل 15 دقيقة لخلط الوسط مع الخلايا. بعد ذلك ، أضف 25 مل من وسائط Grace الكاملة التي تحتوي على 10٪ FBS ، و 100 ميكروغرام لكل مليلتر من المضادات الحيوية البنسلين والستربتومايسين.

احتضان اللوحة لمدة ثلاثة أيام في حاضنة 27 درجة مئوية للحصول على فيروس المرور P1. بعد ذلك ، اجمع المادة الطافية في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. تدور في 1 ، 010 مرات جم لمدة خمس دقائق لإزالة بقايا الخلية.

صب المادة الطافية في أنبوب نظيف ، وتخزينها على درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى عام واحد أو حتى تصبح جاهزة للاستخدام. لتضخيم الفيروس من ممر P1 إلى P2 ، قم أولا بزراعة طبقة أحادية من خلايا Sf9 على صفيحة 150 ملم إلى 90٪ التقاء. بمجرد الوصول إلى التقاء المطلوب ، استنشق الوسط.

أضف ملليلترين من فيروس P1 واحتضنه لمدة ساعة واحدة في حاضنة 27 درجة مئوية. كرر خطوات التضخيم للحصول على ممرات P2 و P3 من الفيروس. في هذه الدراسة ، يتم استخدام ناقلين معدلين للتعبير عن الفيروس الباكلي pFastBac1 للتعبير عن البروتينات المفرزة إما بتسلسل إشارة gp67 أو الهيمولين عن طريق استبدال تسلسل الإشارة الجوهري للجين المستهدف.

يتم استخدام PBEC gp67 بنجاح للتعبير عن المجالات خارج الخلية لمستقبلات a-thal-leano TDR. بينما يتم استخدام الهيمولين PBEC1 بنجاح للتعبير عن المجال خارج الخلية PRK3. بعد ذلك ، تتركز البروتينات المنقاة إلى خمسة ملليغرام لكل مليلتر ، وتخضع لفحص التبلور.

يتم تحسين الظروف التي أسفرت عن بلورات أولية لكل بروتين حتى يتم ملاحظة بلورات البروتين التي يزيد حجمها عن 20 ميكرومتر. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنهم يفحصون جودة البروتينات حسب اللونيات المستبعدة من الحجم ، وتشتت الضوء متعدد الزوايا ، والمقايسات الأخرى لحالة عدم تجميع البروتين المؤتلف. لا تنس ، للتحقق من نقاء البروتين أيضا عن طريق وصمة عار الفضة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل علم البلورات بالأشعة السينية و cryo-EM من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل الهياكل ثلاثية الأبعاد للبروتين المنتج. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا الهيكلية لاستكشاف الخصائص الهيكلية والوظيفية والكيميائية الحيوية للبروتينات المفرزة من النباتات والثدييات. لا تنس أن العمل مع الأشعة فوق البنفسجية لتصور عصابات الحمض النووي على هلام الاغاروز يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء الحماية من الأشعة فوق البنفسجية ، وواقي الوجه ، ونظارات العين ، ومعطف المختبر ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

أيضا أثناء عمل المخازن المؤقتة ، كن حذرا أثناء التعامل مع الأحماض والقواعد القوية.