تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين
January 23rd, 2019
يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة للترادف الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (تشيب-Seq) التي تمكن من تحليل الخلية-نوع معين على نطاق الجينوم هستون تعديل.
يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الوراثة اللاجينية مثل كم يتم تنظيم التعديلات اللونية بطريقة محددة من نوع الخلية مع الجينوم. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا يمكن أن نعزل الكروماتين من الخلايا المستهدفة ومن ثم اتباع المصب الغجري النموذجي. حتى هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى في الخلايا العصبية تقليم محددة، lysinc 4، opisoncilly.
ويمكن أيضا أن تطبق على تعديل الحجر الهوتي الأخرى، وأنواع الخلايا الأخرى، ومن ثم الكائنات الحية نموذج آخر. (سيثبت الإجراء أن (ماري ميتو، تقني من مختبري للبدء ، استخدم مقص ربيعي جيد لتشريح الأنسجة ذات الاهتمام إلى قطع صغيرة.
إضافة شظايا الأنسجة إلى وعاء نظيف مملوء بالنيتروجين السائل. ثم، نقل شظايا الأنسجة إلى أنابيب ملليلتر اثنين مليئة النيتروجين السائل. تخزين الأنابيب في ناقص 80 درجة مئوية لمدة خمس دقائق مع غطاء مفتوحة لتبخر النيتروجين السائل.
ضع الأنابيب التي تحتوي على عينات الأنسجة على رف الجليد المعدني المبرد. ثم ضع رصاصة معدنية في أنبوب 1.5 ملليلتر وقم بتبريدها بالنيتروجين السائل. ضع الرصاصة المعدنية المبردة على أحد الأنابيب العينة.
أغلق الغطاء واضبط الأنبوب في حامل الأنبوب لمطحنة التبريد. على الفور، تراجع حامل أنبوب تجميعها في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة. أدخل حامل الأنبوب المجمد في الكاسيت الخارجي للمطحنة المبردة.
و هزها بقوة لمدة 30 ثانية، 60 مرة. بعد ذلك، تفكيك طاحونة خفي، إزالة الرصاصة المعدنية. ووضع الأنبوب في مبرد عينة مبردة مسبقًا.
تخزين برودة في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم، إضافة 900 ميكرولترات من 1٪ الفورمالديهايد إلى أنبوب وماصة لخلط. نقل التعليق إلى أنبوب ملليلتر جديد مع 900 ميكرولترات من 1٪ الفورمالديهايد.
بعد ذلك، قم بإصلاح التعليق لمدة 10 دقائق مع دوران لطيف عند درجة حرارة 23 درجة مئوية. لوقف التفاعل التثبيت، إضافة 100 ميكرولترات من 2.5 جليسين المولر إلى الأنبوب. وطاردة مركزية في 3000 مرة الجاذبية لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
بعد هذا، تجاهل السوبر سوبرنانت. إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب ودوامة لخلط. جهاز طرد مركزي في 3،000 مرة الجاذبية لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
كرر هذه الخطوة غسل، مرتين أكثر. المقبل، إضافة 500 ميكرولترات من تحلل العازلة واحد إلى بيليه وماصة لخلط. جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق في 3،000 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية والتخلص من فائقة.
إضافة ملليلتر واحد من العازلة تحلل اثنين إلى بيليه ودوامة لخلط. ثم، الطرد المركزي تعليق لمدة خمس دقائق في 3،000 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية والتخلص من عظمى. بعد هذا، إضافة 800 ميكرولترات من عازلة فحص المناعة الراديوية مع كوكتيل مثبطات البروتياز إلى بيليه وماصة لخلط.
الطرد المركزي تعليق لمدة خمس دقائق في 3،000 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية والتخلص من فائقة. المقبل، إضافة 500 ميكرولترات من العازلة RIPA مع كوكتيل مثبطات البروتياز إلى بيليه. ثم، الطرد المركزي تعليق لمدة خمس دقائق في 3،000 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية والتخلص من عظمى.
إضافة ملليلتر واحد من العازلة RIPA مع كوكتيل مثبطات البروتياز. مباشرة بعد إضافة RIPA العازلة مع كوكتيل مثبطات البروتياز، نقل lysate إلى أنبوب sonicator. ووضع الأنبوب على أوفوق الصوتيات.
باستخدام الإعدادات الموضحة في بروتوكول النص، اجز الكروماتين. ثم, نقل العينة إلى 1.5 ملليلتر بروتين انخفاض ربط أنبوب. و جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق في 20،000 مرة الجاذبية عند أربع درجات مئوية.
جمع افرا من العينة ونقلها إلى بروتين جديد انخفاض ملزمة أنبوب. في هذا البروتوكول، تم إدخال تسلسل صفاء المناعة جنبا إلى جنب مع الكروماتين وبرهن. أثناء الإجراء، تم اختبار نوعية الحمض النووي في خطوات متعددة.
مباشرة بعد سونيكيشن، تم عزل الحمض النووي مُخَصَّص واختُبِضَ مع آلة الكهرباء الدقيقة الفُذرية. بعد استخدام الأجسام المضادة لـ FLAG والأجسام المضادة H3K3me3 لإجراء تنقية التقارب تم فحص جودة الحمض النووي مرة أخرى. تم تأكيد خصوصية تنقية الحمض النووي المناعي على H2B-FLAG مع عينات التحكم السلبية.
حيث تم الكشف عن كميات لا تذكر من الحمض النووي. وفي البروتوكول الإضافي، تم التحقق من جودة مكتبة التسلسل. وقد تم إثبات ChIP الناجحة و T-ChIP من خلال تحليل الإثراء باستخدام الأقواس التي تستهدف المنطقة المروجة لجين GAPDH.
تم الحصول على إعادة توزيع تمثيلية على طول ثلاث جينات الخلايا العصبية. ولوحظ إثراء يقرأ في نهايات خمسة رئيس الجينات من قبل الخلايا العصبية T-ChIP تسعى على الدماغ كله T-ChIP البحث. بعد stabiliment، هذه التقنية يمهد الطريق للباحثين في مجال اللاجينية لاستكشاف نوع الخلية تعديل حجر الهستون محددة عامة على نطاق واسع في الخلايا العصبية في الفئران.
لا تنس أن العمل مع الفورمالديهايد يمكن أن تكون خطرة للغاية واتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء الملابس المطاطية والنظارات ينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً لتسلسل الترسيب المناعي للكروماتين المتتالية (tChIP-Seq)، مع التركيز على قابليته للاستخدام في تحليل التعديلات الهيستونية الخاصة بنوع الخلية في الجينوم. من خلال عزل الكروماتين من الخلايا المستهدفة، تتيح هذه الطريقة للباحثين استكشاف التنظيم الفوقي الوراثي وإثراء الرؤى حول التعديلات الهيستونية الخاصة بالخلايا العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- علم التوارث اللاجينومي
- تحليل تعديل الهستون
- خصوصية نوع الخلية
الخلفية
- أهمية تعديلات الكروماتين في الوظيفة الخلوية
- الإمكانية لفهم تطور الخلايا العصبية ووظيفتها
- الحاجة إلى أساليب دقيقة لدراسة تعديلات الهستون
الأساليب المستخدمة
- تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين المتتالية (tChIP-Seq)
- خلايا عصبية من الفئران كنموذج بيولوجي
- التنقية بالارتباط والرحلان الكهربائي للتحقق من جودة الحمض النووي
النتائج الرئيسية
- تأكيد إثراء التعديلات الهيستونية الخاصة بالخلايا العصبية
- إثبات خصوصية التنقية المناعية مع ضوابط سلبية
- ملاحظات مفصلة للتعديلات الهيستونية على طول جينات الخلايا العصبية
الاستنتاجات
- توفر هذه الدراسة بروتوكولًا قيمًا لاستكشاف التعديلات الهيستونية بطريقة خاصة بنوع الخلية.
- تسلط الضوء على أهمية tChIP-Seq في تطوير البحث في علم التوارث اللاجينومي، خاصة في فهم بيولوجيا الخلايا العصبية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific epigenome profiling addresses a critical gap in target validation by enabling precise interrogation of histone modifications in defined cellular populations. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by reducing biological noise from heterogeneous tissues. tChIP-Seq supports mechanistic de-risking in early discovery by linking epigenetic states to functional outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through cell-type-specific chromatin state mapping.
- Operational Value: Provides biological de-risking by isolating epigenetic signals from target cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying mechanistic pathways in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream epigenetic screening workflows.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled chromatin isolation.
- Scalability: Enables platform reuse across histone modifications and model organisms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance from discovery through preclinical validation via neuron-specific epigenome profiling.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions by linking histone modification patterns to functional gene expression.
- Biomarker Alignment: Facilitates translational biomarker development through epigenomic readouts in target cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing epigenomic resolution in purified cell types.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through cell-type-specific chromatin analysis.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs for compound effect evaluation.
- Analytics: Generates enrichment measurements and sequencing readouts that enable condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via neuron-specific epigenome profiling in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for epigenetic profiling across projects and histone marks.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epigenetic regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of chromatin isolation workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on epigenomic fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetics, molecular biology, and nucleic acid handling.
- Needs cryogenic grinding, sonication, and immunoprecipitation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for chromatin preparation and antibody validation.
- Involves adaptation considerations across model systems and histone modification targets.
- Includes practical limitations such as tissue accessibility and formaldehyde handling hazards.
