اختﻻق الكلي لحاء خارج الخلية المستمدة من مصفوفة المائية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المواد الحيوية، مثل كيفية تأثير تفاعلات مصفوفة الخلايا على الكبريتات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تولد المادة الأولى التي تعكس بدقة البيئات الدقيقة البيوكيميائية القشرة الكلية الأصلية. خط غطاء لثقافة الأنسجة مع لوحة تحت.

ضع قاربًا لترًا واحدًا يحتوي على بار ضجة ، طبق زراعة الأنسجة العقيمة 150 ملليمترًا ، والكلى بأكملها في غطاء محرك السيارة. ملء القارس مع 500 ملليلتر من 1 ٪ SDS الحل. وضع الكلى في طبق ثقافة الأنسجة العقيمة.

إزالة جميع الدهون البيرنية عن طريق الحلاقة طفيفة حول كبسولة الكلى مع مشرط. ثم، جعل شق ضحلة من ثمانية إلى 10 سنتيمترا عبر الطرف متفوقة من الكلى، لكسر الكبسولة الكلوية دون الإضرار أنسجة القشرة الكامنة. استخدام اثنين من المشابك الهيموستات لإزالة كبسولة الكلى بتقشير بعيدا عن أنسجة القشرة.

اِصف الكلى على طول الطائرة التاجية باستخدام المشرط على طول الجانب الجانبي من الكلية. عزل أنسجة القشرة من كلا النصفين عن طريق نحت منطقة النخاع مع المشرط. ثم، الزهر الأنسجة القشرة في قطع مكعبة 0.5 سم، وإزالة أي كبيرة، والأوعية مرئية.

لعزل المصفوفة خارج الخلية من الكلى، ضع أنسجة القشرة المقطّع في الكوابر التي تحتوي على محلول SDS. تغطية كوب مع رقائق الألومنيوم autoclaved ووضعها على لوحة ضجة في حوالي 400 دورة في الدقيقة، خارج غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة. بعد 24 ساعة من التحريك، جلب القارب إلى غطاء لثقافة الأنسجة.

إضافة 40 ميكرون مصفاة خلية معقمة مصنوعة من شبكة النايلون. وبعد ذلك، ملء منقار 1000 ملليلتر منفصلة مع 200 ملليلتر من التبييض، ووضعها في غطاء غطاء ثقافة الأنسجة. تخلص من محلول SDS من خلال مصفاة الخلايا ، في القارص التي تحتوي على التبييض.

Pipet من أي حل SDS المتبقية، حتى الأنسجة فقط decellularized ومصفاة الخلية تبقى في beaker. اترك مصفاة الخلايا في القارس، وأضف 500 ملليلتر من محلول SDS الطازج. غطي كوبه بنفس رقائق الألومنيوم، وضعها على لوحة تحريك بنفس السرعة التي كانت عليها من قبل.

بعد إزالة الخلايا والغسيل، نقل الأنسجة منزوعة الخلية، ويشار إلى الكلى ECM من هذه النقطة على، إلى أنبوب مخروطي 30 ملليلتر الذاتي. وملئه بـ ماء من نوع ثقافة الخلية حتى يتم غمر كل الأنسجة أولاً، استخدم التجانس الأنسجة لتجانس ECM الكلي في أنبوب مخروطي لمدة دقيقتين، حتى يتم الحصول على حل معتم مع عدم وجود قطع مرئية من ECM.

ثم غمر الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على ECM الكلى في النيتروجين السائل حتى الغليان المحيط الأنبوب لم يعد قائما. تخزين ECM الكلى في ناقص أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. لlyophilize الأنسجة المجمدة decellularized، تخفيف قليلا غطاء أنبوب مخروطي للسماح لتبادل الغاز، ووضع الأنبوب في آلة التجميل.

Lyophilize ECM الكلى لمدة ثلاثة أيام، أو حتى يشبه غرامة، مسحوق أبيض. هضم كيميائيا و solubilize هلام، إضافة تزن بعناية البيبسين المعدة المسامين، و 0.01 حمض الهيدروكلوريك العادي إلى حقير التلألؤ التي تحتوي على شريط ضجة. يُحرّك المزيج عند حوالي 500 دورة في الدقيقة، حتى يذوب كل البيبسين.

ثم, نقل ECM الكلى المزيل لتحلل إلى الخسيس التلألؤ وترك الحل على لوحة ضجة في ما يقرب من 500 دورة في الدقيقة لمدة ثلاثة أيام لجعل الأسهم الكلى ECM هيدروجيل. في غطاء لثقافة الأنسجة، pipet المجلدات المطلوبة من وسائل الإعلام ثقافة الخلية، وهودروكسي الصوديوم واحد طبيعي وملحق M199، في أنبوب مخروطي مخروطي 30 ملليلتر معقم. اخلط محلول الكواشف المحايد مع ملعقة صغيرة.

استخدام حقنة معقمة واحدة ملليلتر لنقل الحجم المناسب من الأسهم الكلية هيدروجيل ECM إلى حل الكواشف تحييد. استخدام ملعقة صغيرة لخلط بلطف الحل حتى متجانسة في اللون، يتم الحصول على حل هيدروجيل. تجنب إدخال فقاعات الهواء عن طريق تحريك ببطء ولطف.

لدمج الخلايا في الهيدروجيل ECM الكلي، resuspend ثلاثمائة ألف خلية في 10 ميكرولترات من المتوسطة لكل هيدروجيل. Pipet 10 ميكرولترات من تعليق الخلية في هلام الكلية ECM النهائي. يحرك الحل مع ملعقة صغيرة حتى يتم توزيع الخلايا بالتساوي.

استخدام حقنة ملليلتر واحد لملء الجهاز المطلوب خلية ثقافة مع هيدروجيل ECM الكلي. السماح للجل لتعيين في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل نقل أو طلاء الخلايا على ECM الكلي في الجهاز ثقافة الخلية. تحليل أنسجة القشرة decellularized عن طريق القياس الطيفي الشامل، وكشف عن وجود البروتينات المرتبطة لامينا الريحان، مع الكولاجين الرابع والكولاجين-الأول يجري الأكثر تمثيلا.

تم حفظ سلاسل الكولاجين-IV و A1 و A2، في كل مكان في جميع أغشية الطابق السفلي. كما تم الكشف عن سلاسل الكولاجين-IV و A3 و A5، الموجودة فقط في أغشية الطابق السفلي من الكبيات. كما تم الكشف عن أشكال ISO الشائعة من اللامينين والكولاجين الأول.

وأظهرت الخلايا البطانية الدقيقة الوعائية الدقيقة الكلى الدقيقة، أو HKMECs، المستزرعة على الكولاجين-الأول، والكلية ECM، وهلم الخليط 1:1، اختلافات في النمط الظاهري. HKMECs مثقف على الكولاجين-I، عرض موحدة التعبير CD31، ينظر في الأحمر. في حين HKMECs المستزرعة على اثنين من المواد الهلامية التي تحتوي على ECM الكلي، عرض انخفاض التعبير CD31 في توزيعات متفاوتة.

لم يظهر نوع المصفوفة للتأثير على تعبير VWF، الموضح باللون الأخضر. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تجانس تماما أنسجة قشرة الكلى decellularized. وعلاوة على ذلك، عند خلط الجل مع الكواشف تحييد، وتجنب إدخال فقاعات الهواء.

تسمح الأنظمة الفسيولوجية الدقيقة بدراسة وظائف الأعضاء في بيئة مختبرية خاضعة للرقابة. ويتطلب إنشاء مثل هذه النظم تنفيذ الخلايا والمصفوفات والمحفزات. وeECM هيدروجيل ملفقة هنا، وسوف تسمح لنا لدراسة مثل هذه النظم التي تختب البيئات الكلية الصغيرة.