كشف وعزل الهيئات أبوبتوتيك بدرجة نقاء عالية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو اكتشاف وعزل الأجسام موت الخلايا المبرمج إلى درجة نقاء عالية. الأجسام موت الخلايا المبرمج هي نوع من الحويصلات خارج الخلية التي يتم إنشاؤها للمساعدة في تحريض داء الدم. إنها أكبر نوع من العائلة الفيزيائية خارج الخلية يتراوح قطرها عادة من واحد إلى خمسة ميكرومترات.

من الواضح الآن أن الأجسام موت الخلايا المبرمج يمكن أن تساعد في العمليات الخلوية ، مثل إزالة الخلايا المبرمج والاتصال داخل الخلايا. لذلك ، فإن تطوير منهجية دقيقة للكشف عن الأجسام المبرمج وقياسها وعزلها أمر بالغ الأهمية لتخصيص وظائفها وآلياتها. في هذه السلسلة من المشاهدات ، سنوضح لك كيفية اكتشاف وقياس وعزل أجسام موت الخلايا المبرمج من عينات موت الخلايا المبرمج.

الجزء أ ، تحريض موت الخلايا المبرمج. للحث على موت الخلايا المبرمج في خطوط الخلايا ، مثل الخلايا الوحيدة THB1 ، ابدأ أولا بجمع الخلايا. عد الخلايا وجمع ما يقرب من 10 ملايين خلية أو حسب الحاجة.

نوصي ب 10 ملايين لتحليل الأجسام موت الخلايا المبرمج. Alloquate مليوني خلية لكل بئر من ستة ألواح آبار. قم بإزالة الغطاء من لوحة البئر الستة وخلايا الأشعة فوق البنفسجية باستخدام UV Stratalinker 1800.

تشعيع الخلايا عند 150 مللي جول لكل سنتيمتر مربع. يجب أن يستغرق هذا التشعيع حوالي 30 إلى 60 ثانية. بعد اكتمال التشعيع ، احتضن الخلايا لمدة ساعتين إلى ثماني ساعات ، اعتمادا على خط الخلية.

في هذه المرحلة ، يجب أن تظهر الخلايا مورفولوجيا موت الخلايا المبرمج ، مثل النفقات المبرمجة وتكوين الجسم موت الخلايا المبرمج. اجمع الخلايا موت الخلايا المبرمج باستخدام ماصة P1000. اجمع ما يقرب من 1/10 من عينة موت الخلايا المبرمج للتحكم في عينة موت الخلايا المبرمج بالكامل.

اجمع أيضا عينة غير معالجة أو قابلة للحياة. جهاز الطرد المركزي لكل من عينة موت الخلايا المبرمج بأكملها والعينة غير المعالجة عند 3 ، 000 جرام لمدة ست دقائق. أعد التعليق في PBS واتركه جانبا على الجليد.

لعزل الجسم موت الخلايا المبرمج ، استمر في الخطوة B أو C ، عزل الجسم موت الخلايا المبرمج باستخدام FACS. الطرد المركزي عينة موت الخلايا المبرمج المتبقية عند 3 ، 000 جم لمدة ست دقائق. قم بإزالة المادة الطافية من عينة موت الخلايا المبرمج المتبقية.

أعد تعليق عينة موت الخلايا المبرمج المتبقية في محلول تلطيخ يحتوي على nexum 550 و topo three staining لمدة 10 دقائق ، في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليقه في مخزن FACS ثم قم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون لضمان فصل الخلايا بكفاءة. قم بإجراء إعداد قياسي لجهاز FACS.

احصل على عينة موت الخلايا المبرمج بالكامل وقم بتغيير إعدادات الجهد للتأكد من أن جميع الأحداث داخل روبوتات FACS ويمكن فصل السكان بسهولة. قم بإعداد استراتيجية البوابات كما هو موضح في قسم استراتيجية بوابات قياس التدفق الخلوي لاحقا. حدد مجموعة الجسم موت الخلايا المبرمج المسورة والعدد المطلوب من أجسام موت الخلايا المبرمج للتجميع.

قم بإجراء فرز أولي لتأكيد إعدادات الفرز ونقاء الجسم موت الخلايا المبرمج. بعد إجراء الفرز ، قم بإجراء تدفق أسود للنظام وأعد تحليل العينة التي تم فرزها. إذا تم تحقيق نقاء عال ، فاستمر في فرز العدد المطلوب من أجسام موت الخلايا المبرمج.

بمجرد اكتمال الفرز ، خذ جزءا صغيرا من عينة جسم موت الخلايا المبرمج الاحترافي وأعد تحليلها لتأكيد النقاء. الجزء ج ، عزل الجسم موت الخلايا المبرمج عن طريق الطرد المركزي التفاضلي. الطرد المركزي عينة موت الخلايا المبرمج المتبقية على حرارة 300 جرام لمدة 10 دقائق.

ستعمل خطوة الطرد المركزي هذه على فصل الخلايا ، بما في ذلك الخلايا المبرمج ، والخلايا القابلة للحياة ، والخلايا النخرية عن الحويصلات الصغيرة خارج الخلية ، والتي ستبقى في المادة الطافية. في أنبوب صقر جديد ، اجمع المادة الطافية التي تحتوي على الحويصلات خارج الخلية. أعد تعليق الفصيل المخصب المبرمج في PBS واتركه جانبا على الجليد مع عينات موت الخلايا المبرمج غير المعالجة والكاملة.

جهاز طرد مركزي المادة الطافية التي تم جمعها والتي تحتوي على أجسام موت الخلايا المبرمج عند 3 ، 000 جرام لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على الحويصلات الأصغر خارج الخلية ، مع الحرص على عدم تعطيل الحبيبات التي ستحتوي على الأجسام موت المبرمج. أعد تعليق الأجسام موت الخلايا المبرمج في PBS واجمع 100 ميكرولتر من كل عينة موت الخلايا المبرمج الكاملة غير المعالجة ، والخلايا موت الخلايا المبرمج المخصبة ، والأجسام موت الخلايا المبرمج المخصبة العينة والبقعة بمحلول تلطيخ nexum five و topo three.

قف في الظلام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. تحليل كما هو موضح في استراتيجية البوابات الموضوعة. الجزء D ، استراتيجية بوابات قياس التدفق الخلوي.

لبدء تحليل قياس التدفق الخلوي ، افصل ثلاث خلايا نخرية عالية من جميع الأحداث الأخرى عن طريق مقارنة توبو ثلاثة وأربعة معا. من أحداث عدم النفاذية ، قم بتنفيذ البوابة التالية. حدد أحداث عدم النفاذية وقارن بين مبعثر جانبي على nexum five.

حدد مجموعتين ، بما في ذلك مبعثر جانبي وسيط في ارتفاع ، وخمس خلايا منخفضة إلى متوسطة. هذه المجموعة هي P1. قم أيضا بإنشاء مجموعة سكانية ثانية بما في ذلك جميع الأحداث الأخرى. هذه المجموعة هي P2. سيحتوي P1 على خلايا قابلة للحياة وخلايا موت الخلايا المبرمج المبكرة.

سيحتوي P2 على جميع أحداث موت الخلايا المبرمج والحطام. حدد P2 لمزيد من البوابات. من P2 ، قم بإزالة كل الحطام من خلال مقارنة topo three verse a nexum five.

حدد كل أحداث nexum الخمسة المتوسطة والعالية. ستشمل هذه المجموعة الآن جميع أجسام موت الخلايا المبرمج والخلايا موت الخلايا المبرمج. حدد هذه المجموعة.

لفصل الأجسام موت الخلايا المبرمج عن الخلايا المبرمجة ، قارن التشتت الكامل بالرابطة الخمسة. لتحديد الأجسام موت الخلايا المبرمج، حدد انخفاضا كاملا للتبعثر. لتحديد الخلايا موت الخلايا المبرمجة، حدد التشتت الكامل المتوسط إلى الأحداث العالية.

عند إجراء عزل الجسم موت الخلايا المبرمج بواسطة FACS ، نوصي بتنفيذ استراتيجية بوابة نهائية واحدة عن طريق تحديد جزء الجسم موت الخلايا المبرمج وعرضه بواسطة topo three verse a nexum five. حدد جميع الأحداث. يستخدم هذا لتحديد استراتيجية البوابات بناء على الإزهار بدلا من خصائص التشتت الكامل والانبعاث الجانبي لزيادة دقة الفرز.

لتحديد الخلايا القابلة للحياة ، ارجع إلى مجموعة P1. لتحليل الخلايا القابل للحياة بشكل عام ، حدد P1 وقارن التشتت الكامل ب nexum five. حدد كل الخلايا الوسيطة إلى العالية الكاملة للتبعثر.

سيشمل ذلك جميع الخلايا القابلة للحياة ، وإزالة أي حطام متبقي. بدلا من ذلك ، لمزيد من تحليل موت الخلايا المبرمج بشكل أكثر عمقا ، يمكن فصل الخلايا المبرمجة القابلة للحياة والمبكرة. لهذا ، قارن بين المبعثر الكامل لثلاثة أبية.

ستكون الخلايا القابلة للحياة عبارة عن ثلاثة مبعثر منخفض وكامل من المتوسط إلى العالي. تحتوي الخلايا المبرمجة المبكرة على تلطيخ توبو ثلاثة وسيط. يمكن بعد ذلك تطبيق استراتيجية البوابات بأكملها على جميع العينات التي يتم تحليلها.

على سبيل المثال ، بالنسبة للأجسام موت الخلايا المبرمج المعزولة بعد FACS. تطبيق استراتيجية البوابات على جميع العينات. يمكن بعد ذلك تحضير نقاء الجسم موت الخلايا المبرمج.

على سبيل المثال ، عن طريق تحديد nexum خمسة مجموعات موجبة فقط ، ومقارنة التشتت الكامل و nexum five. هذا يوضح بالتالي الأجسام موت الخلايا المبرمج بعد العزلة. النتائج التمثيلية.

تم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي لتأكيد تحريض موت الخلايا المبرمج. تسمح استراتيجية البوابات هذه بتحديد الخلايا القابلة للحياة ، والخلايا المبرمجة المبكرة ، والخلايا المبرمجة المتأخرة ، والخلايا الميتة في العينة المشعة بالأشعة فوق البنفسجية. أظهرت هذه المنهجية عزل الأجسام موت الخلايا المبرمج بنهجين.

أولا ، نهج قائم على FACS ، حيث تم إثراء الأجسام موت الخلايا المبرمج إلى نقاء 99٪ ونهج الطرد المركزي التفاضلي حيث تم عزل الأجسام موت الخلايا المبرمج إلى نقاء 97٪. تم تأكيد ذلك من خلال قياس التدفق الخلوي حيث تم فصل الأجسام موت الخلايا المبرمج بواسطة الخلايا ، بما في ذلك الخلايا القابلة للحياة ، والخلايا المبرمجة ، والنخراد. استنتاج. قد يوفر نهجنا أداة جديدة لأبحاث موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا

وبالتالي المساهمة في تقدمها في إضفاء الطابع الشخصي على هذه الآليات والمساعدة في إحداث تطورات جديدة في استهداف هذه العمليات.