إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر
October 28th, 2018
نقدم هنا دليلاً عمليا لبناء نظام متكامل الفحص المجهري، والذي يدمج التقليدية برنامج التحصين الموسع-فلوري التصوير، وتصوير فائقة جزيء واحد القرار القائم على الكشف، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك نقل الطاقة صدى الأسفار جزيء واحد التصوير، إلى إنشاء واحدة بطريقة فعالة من حيث تكلفة.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المجهر البصري، مثل كيفية التقاط صور فائقة الدقة بالإضافة إلى صور FRET باستخدام نفس المجهر. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا يمكن أن الجمع بين ثلاث وحدات التصوير المختلفة في مجهر واحد، والحد بشكل كبير من التكلفة الإجمالية. العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم تجميع مسار الإثارة.
أنها تتطلب اختيار صحيح من أجزاء والمحاذاة البصرية الحساسة. للبدء، قم بتثبيت بطاقة الحصول على البيانات من خلال واجهة PCI واستخدامها لتوصيل أجهزة الليزر بالكمبيوتر. التحكم في lasers'on وإيقاف السلوكيات بواسطة إنتاج منطق الترانزستور والترانزستور وتعديل الطاقة الخاصة بهم من قبل الإخراج التناظري لهذه البطاقة.
بعد ذلك، قم بإعداد جدول بصري معزول للاهتزاز مع مرايا ومقسمات شعاع كما هو موضح هنا وموصوف في بروتوكول النص المصاحب. الجمع بين أشعة الليزر في الألياف الضوئية وضع واحد من خلال تركيب أول لوحة محول الألياف في جبل ترجمة محور ض. بعد ذلك، قم بتركيب عدسة مزدوجة اللونية في لوحة قفص.
استخدام قضيب تمديد لتوصيل محول والعدسة لتشكيل قفص. ثم، استخدام بوصة واحدة وظائف البصرية سميكة لتركيب القفص على الجدول البصري. محاذاة الليزر 647 نانومتر عن طريق ضبط المكونات للحصول على أقصى انتاج الطاقة الليزر من خلال الألياف.
بمجرد الانتهاء من محاذاة الليزر الأول، تثبيت مؤقتا زوج من القزحيات ومحاذاة بقية الليزر واحدا تلو الآخر. تحقق من كفاءة المحاذاة لكل ليزر مع عداد الطاقة. تأكد من ترك واحدة القزحية أمام لوحة محول للحد من انعكاسات الليزر.
بعد ذلك، قم بتصميم عدسة التكبير وتثبيتها كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. من أجل خلق تأثير الاستجماتيزم اللازمة لاستخراج الإحداثيات ض من كل جزيء واحد، وضع عدسة 3D مع طول بؤري 10 متر في الكاسيت وإدراجه في مسار شعاع الانبعاثات. لتقليل الاهتزازات أثناء التصوير المتسلسل للتصوير المتسلسل للرائع المتعددة الألوان، استخدم مرشحات الانبعاثات الموضوعة في عجلة مرشحات حاجز متصلة بجانب المجهر.
للكشف المتزامن متعدد الألوان أثناء تجارب FRET أحادية الجزيء، ضع فلترًا آخر في مقسم الانبعاثات. لإعداد للتصوير محدودة الانعراج باستخدام الإثارة epi- الإثارة، أولاً ضبط زاوية الليزر الإثارة العرضية لوضع epi في ذراع الإضاءة. بعد ذلك، فك الارتباط عدسة 3D، وإدراج مكعب الالتفافية في مقسم الانبعاثات.
ثم، إدراج عدسة ماج لتوسيع الإضاءة. بمجرد إعداد، واتخاذ متعددة القنوات، Z-المكدس، و / أو الوقت المنقضي الصور من العينة الخاصة بك على أساس النتائج المرجوة. لإعداد الكشف متعدد الألوان جزيء واحد من الجزيئات التي شلت سطح، أولاً نقل عجلة التصفية إلى وضع فارغ.
هذا سيسمح لأشعة الليزر بالمرور. ثم، ضبط lasers'incidental زاوية الإثارة إلى زاوية العشب، وفك الارتباط على حد سواء ماج و 3D العدسات. بعد ذلك، قم بإشراك وضع القنوات الثلاث في مقسم الانبعاثات عن طريق استبدال مكعب الالتفافي أولاً بمكعب معايرة يسمح لجميع الضوء بالمرور عبر جميع القنوات.
ثم، تشغيل الكاميرا تحت DIC وضبط الفتحة من المقاين الانبعاثات حتى ثلاثة، قنوات منفصلة تماما تظهر على الشاشة. بدوره المقابض ضبط ضبط أفقي عمودي على مقسم الانبعاثات، ومحاذاة تقريبا القنوات الثلاث. بعد ذلك، قم بإيقاف تشغيل الكاميرا واستبدال مكعب المعايرة بالمكعب الثلاثي.
ضع عينة من حبات متعددة القنوات من 100 نانومتر. عند الإثارة في 488 نانومتر، الخرز متعدد القنوات 100 نانومتر تنبعث أطوال موجية مختلفة من الضوء، مما يتيح محاذاة ثلاث قنوات. ثم، بدوره على الكاميرا و488 نانومتر الليزر، والتكبير على واحدة من الخرز مشرق، وأخيرا محاذاة القنوات الثلاث عن طريق تحويل المقابض التحكم التكيف مرة أخرى.
مع عينة الآن في مكان، وذلك باستخدام ليزر ضعيفة، انتقل إلى منطقة مع كثافة بقعة معقولة وضبط قوة الليزر ووقت التعرض لتحقيق مقبولة إشارة إلى الضوضاء ومستويات photobleaching. ثم استخدم برنامج التصوير لالتقاط صور زمنية. للتصوير فائق الدقة، ابدأ بإدخال العدسة ثلاثية الأبعاد وإزالة العدسة الماغ.
ثم تحديد زاوية الليزر الإثارة الأمثل العرضية لتكون زاوية العشب. من أجل العثور على الارتفاع الهدف المناسب للتصوير ريال، استخدم التصوير DIC للعثور على المستوى الأوسط من الخلايا. تحديد المستوى حسب الارتفاع الذي تصبح فيه الخلايا شفافة.
بمجرد تحديد الطائرة البؤرية المطلوبة، ابدأ التصوير فائق الدقة. أثناء التصوير، قم بتغيير قوة الليزر 405 نانومتر للحفاظ على كثافة معقولة من البقع الوميض على. ابدأ التصوير بدون طاقة ليزر بنفسجية.
عد عدد البقع الوامضة في فترة معينة وزيادة طاقة الليزر البنفسجية بحيث يتم الاحتفاظ بعدد البقع الوامضة فوق عتبة العد المعرفة من قبل المستخدم في مجال العرض. تحليل البيانات عن طريق الكشف عن المركزيةات من كل بقعة في إطارات التصوير واستخراج قيم ض لكل بقعة من العاشر و س العرض. بناء صورة أعيد بناؤها وتصور الكائنات في 3D.
يسمح إعداد المجهر هذا بالتبديل المرن والقابل للاستنساخ بين طرق التصوير المختلفة، بما في ذلك التصوير التقليدي للقطع الضوئية، والتصوير فائق الدقة القائم على الكشف عن الجزيئات المفردة، والكشف متعدد الألوان عن الجزيء المفرد. من أجل الكشف عن التفاصيل الدقيقة في الجمعية الجزيئية ، يجمع المجهر فائق الدقة بين الآلاف من الصور مثل هذا. ثم يتم إعادة بناء هذه الصور لتوليد صورة نهائية فائقة الدقة.
تسمح تقنيات الدقة الفائقة بدقة مكانية عالية ، مما يوفر تفاصيل لا يمكن رؤيتها باستخدام تقنيات أخرى. وهذا ما تم إبرازه في الصورتين المعروضتين هنا. تظهر الصورة فائقة الدقة نفس RNase البكتيرية التنظيمية مثل صورة epifluorescence ولكنها تسمح باكتشاف جزيء واحد.
SmFRET هو طريقة أخرى قادرة على انجستروم إلى قرار نانومتر. هنا، تم تسمية جزيئات الحمض النووي الريبي المطوية بصبغة متبرعة خضراء وصبغة متقبلة حمراء. يمكن استخلاص مسارات كثافة الفلوريسنس من جزيئات فردية فردية، مما يولد كفاءة فريت كدالة للوقت.
لا تنس أن العمل مع الليزر يمكن أن تكون خطرة، وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء حماية العين أو خفض القوى الليزر دائما حيث تنفيذ هذا الإجراء.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة دليلًا عمليًا لبناء نظام مجهر متكامل يجمع بين التصوير التقليدي الفلوري، والتصوير فائق الدقة، واكتشاف الجزيئات المفردة متعددة الألوان. يهدف الأسلوب إلى تقليل التكاليف مع توفير قدرات تصوير متقدمة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- المجهر الضوئي
- التصوير الفلوري
- تقنيات فائقة الدقة
الخلفية
- يمكن لدمج تقنيات التصوير المختلفة تعزيز قدرات البحث.
- اكتشاف الجزيئات المفردة ضروري للتصوير المتقدم.
- الحلول الاقتصادية ضرورية في المجهر.
- تجميع مسار الإثارة معقد ويتطلب محاذاة دقيقة.
هدف الدراسة
- لتوفير دليل لتجميع نظام مجهر متكامل.
- لإظهار كيفية التقاط صور فائقة الدقة وصور FRET باستخدام نفس الإعداد.
- لتبسيط عملية التعلم للباحثين في المجهر.
الطرق المستخدمة
- تركيب بطاقة اكتساب البيانات من خلال واجهة PCI.
- توصيل الليزر بالكمبيوتر للتحكم.
- استخدام منطقية الترانزيستور للترانزيستور للتحكم في الليزر.
- مخرج تناظري لتعديل قوة الليزر.
النتائج الرئيسية
- يسمح النظام المتكامل بحلول تصوير فعالة من حيث التكلفة.
- تساعد عروض التجميع في الفهم.
- مزج ناجح لوحدات التصوير المتعددة في مجهر واحد.
- قدرة محسنة على إجراء تصوير فائق الدقة وتصوير FRET.
الاستنتاجات
- نظام المجهر المتكامل هو أداة قيّمة للباحثين.
- من الممكن تقليل التكلفة دون المساس بجودة التصوير.
- العروض المرئية ضرورية للتعلم الفعال.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Integrating multiple fluorescence imaging modalities into a single microscope reduces capital expenditure and laboratory footprint while expanding analytical capabilities for target validation and mechanistic studies. This approach supports early discovery workflows by enabling reproducible switching between conventional, super-resolution, and single-molecule FRET imaging without requiring dedicated instruments. The resulting platform enhances predictive confidence in molecular interaction studies and conformational analysis, directly informing lead identification and preclinical de-risking decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through angstrom-resolution conformational tracking and molecular interaction dynamics via smFRET.
- Operational Value: Provides reproducible, label-compatible readouts for target engagement and binding kinetics in native cellular contexts.
- Strategic Value: Supports target de-risking by correlating structural changes with functional outcomes, improving go/no-go criteria in lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, single-molecule-level data for assay standardization and hit confirmation in phenotypic screening campaigns.
- Operational Value: Enables multiplexed detection of molecular species and interactions, increasing information density per assay well.
- Strategic Value: Reduces false positives through direct visualization of target binding events, improving hit-to-lead transition efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker validation by co-localizing therapeutic targets with functional readouts in disease-relevant models.
- Operational Value: Ensures imaging continuity from discovery through preclinical validation using a standardized, reusable platform.
- Strategic Value: Supports mechanism-based go/no-go decisions by providing structural and dynamic insights into target behavior in complex systems.
Pipeline & Workflow Integration
The system bridges early discovery and lead identification by delivering structural and dynamic data that inform target confidence and compound mechanism of action.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of molecular conformations and interactions through smFRET and super-resolution readouts.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative single-molecule outputs for compound screening and counter-screening applications.
- Analytics: Generates FRET efficiency trajectories and z-coordinate-resolved reconstructions for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects in vitro target validation to preclinical models through consistent imaging readouts across scales.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared core capability across target biology, assay development, and preclinical teams, reducing redundant equipment investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility across imaging modes via switchable optical elements.
- Strategic Value: Improves capital efficiency and reduces late-stage biological risk through early, multi-modal target characterization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on structural and functional validation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and fluorescence microscopy principles.
- Depends on vibration-isolated optical tables, precision translation stages, and sensitive detection hardware.
- Necessitates cross-team standardization of filter sets, laser lines, and calibration protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different sample types, including live cells, fixed tissues, and purified complexes.
- Limited by the need for careful optical alignment during mode switching, which impacts throughput if not standardized.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:37
Microscope Design: Assembly of the Excitation Path
2:18
Microscope Design: Assembly of the Emission Path
2:59
Diffraction-limited Imaging with Epi-excitation
3:36
Multi-channel Single-molecule Imaging Including smFRET
5:37
SR Imaging
6:59
Results: Multiple High Resolution Imaging Modes on a Single Fluorescence Microscope
8:11
Conclusion
