عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي لتحليل توليف البروتين الوليدة بأسلوب العلامات غير مشعة L-أزيدوهوموالانيني

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مختلف مجالات أبحاث الأمراض الأيضية حول التعديلات الجزيئية للطاقة الكبدية والتحلل الحيوي للبروتين في السمنة والكبد الدهني غير الكحولي وداء السكري من النوع الثاني. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يسهل عزل خلايا الكبد الماوس الوظيفية الأولية والكشف عن البروتينات الناشئة الكبدية عن طريق الركيزة وضع العلامات غير النشطة. مظاهرة بصرية من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية كما خطوة الضخ من الصعب تعلم بسبب الأوعية الدموية الصغيرة ورقيقة الماوس.

بالنسبة لضخ الكبد، قم بإدخال قسطرة قياس 24 بعناية في Vena Cava أو IVC فقط عند التشعب مع الوريد الكلوي الأيمن. إزالة إبرة القسطرة الحفاظ على موقف من قنية داخل IVC وربط 24 قنية قياس مع أنبوب التسريب باستخدام الموصل. تبدأ في ضخ الكبد مع HBSS دافئ ناقص في معدل تدفق دائم أربعة ملليلتر بسرعة قطع الوريد الجنبي لاستنزاف الدم الداخلي.

بعد 10 دقائق، اثقب كبد الماوس بـ 35 ملليلتر من HBSS بالإضافة إلى مكملاتها مع Collagenase Type X بمعدل تدفق قدره أربعة ملليلترات في الدقيقة، وقط الوريد الزلي لمدة 10 ثوانٍ كل بضع دقائق لتسهيل توزيع الزمر في جميع أنحاء الكبد. عندما تم perfused كل من Collagenase، نقل الكبد إلى أنسجة المختبر قبل وقف المضخة لتجنب تدفق الدم إلى الكبد. استخدام ملقط لإزالة المرارة ومسح بلطف الكبد مع نسيج مختبر جديد لإزالة أي دم.

وضع الكبد في طبق بيتري 100 ملليمتر التي تحتوي على خمسة ملليلتر من HBSS الدافئة الطازجة بالإضافة إلى مكملة مع Collagenase واستخدام ملقط شاردة الرؤوس لإزالة بلطف كبسولة الكبد. استخدام ملقط لتفريق بعناية الأنسجة parenchymal وإضافة 15 ملليلتر DMEM الباردة إلى طبق بيتري. هز الكبد الممزق بلطف لإطلاق الخلايا البارينشيمالية المتبقية في الوسط وإضافة 15 ملليلتر آخر من DMEM الباردة إلى الطبق للحصول على بقية الخلايا.

ثم تصفية ملاط الأنسجة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر على الجليد. لعزل خلايا الماوس الرئيسية، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تثبيت بيليه في 10 ملليلتر من DMEM الطازجة. طبقة الخلايا بعناية على 40٪ كثافة الانحدار العازلة لفصل التدرج الكثافة، وتجاهل الخلايا من الطبقات العليا والوسطى بعد الطرد المركزي.

Resuspend بيليه الكبدية البارينشيمال الأولية مع اثنين إلى ثلاثة ملليلتر من وليام متوسطة E لتجنب جمع الخلايا الميتة من جدار الأنبوب ونقل الخلايا إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر. خلط الخلايا مع سبعة إلى ثمانية ملليلتر إضافية من المتوسط وليام E قبل الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 10، 20، أو 30 ملليلتر من E متوسطة وليام الطازجة اعتمادا على حجم بيليه. بعد العد، بذور ست مرات 10 إلى الخلايا الخامسة إلى كل بئر من لوحة ستة بئر لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات حضانة في 37 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة، واستبدال المتوسطة مع DMEM تكمل مع 10٪ مصل البقر الجنينية ومكافحة لمكافحة لإزالة الخلايا الميتة وغير المرتبطة والعودة إلى الخلايا الحاضنة بين عشية وضحاها. بالنسبة لوضع العلامات على البروتين الناشئ المعدل من أزيد، أضف 20 إلى 40 ميكروغرامًا من الخلايا إلى 50 ميكرولترات من مخزن التفاعل 2X. جلب حجم إلى 80 ميكرولتررس مع الماء المقطر الأيونية ودوامة حل البروتين لمدة خمس ثوان.

إضافة خمسة ميكرولترات من كبريتات النحاس إلى الخلايا دوامة أخرى لمدة خمس ثوان، تليها خمسة ميكرولترات من رد فعل المضافة العازلة واحد مع خمس ثوان من دوامة. بعد حضانة لمدة ثلاث دقائق، إضافة 10 ميكرولترات من رد فعل المعاد تشكيلها العازلة المضافة اثنين إلى الخلايا دوامة ثانية خمس أخرى وتدوير العينة لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية على آلة متعددة الدوار محمية من الضوء. في نهاية التناوب، إضافة 300 ميكرولتر من الميثانول إلى lysate، تليها 75 ميكرولتر من الكلوروفورم، و 200 ميكرولترات من الماء المقطر مزدوجة.

جمع البروتين المسمى عن طريق الطرد المركزي وإضافة 250 ميكرولترات من الميثانول الطازج إلى بيليه. بعد دوامة، الطرد المركزي وlysate مرة أخرى وتغطية بيليه عارية مع الأنسجة الخالية من الوبر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتحليل PAGE، solubilize بيليه المجففة في 20 ميكروليتر من العازلة التحميل دون بيتا mercaptoethanol ودوامة بيليه لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بسخين البروتين في كتلة حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وتحميل العينة على هلام سلفات دوديسيل صوديوم بنسبة 10٪للكشف عن رباعيات اليرث. ثم استخدم ماسح ليزر وضع متغير للكمية الدقيقة من البروتينات الوليدة المسماة AHA. من الناحية النسيجية، تظهر خلايا الكبد الأولية الحية والمتعلقة عادةً متعددة الأضلاع أو سداسية الشكل مع حدود مبروم محددة بوضوح بعد 24 ساعة من الثقافة.

لتأكيد ما إذا كانت الخلايا المعزولة هي خلايا الكبد الأولية، في هذه التجربة، تم مقارنة مستويات التعبير بروتين الألبومين في الخلايا الليفية الجنينية الماوس، خط خلية الكبد الماوس، خلايا الماوس الأولية المعزولة الكبدية الماوس، وكبد الماوس. تم الكشف عن تعبير بروتين الألبومين في خلايا الكبد الماوس الأولية وكبد الماوس، ولكن لم يكن يمكن الكشف عنها في الخلايا الليفية الجنينية الماوس أو خلايا خط خلايا الكبد. كشف العلاج الكبدي الأولي مع 10 ميكرومولار روتينون لمدة أربع إلى ست ساعات عن تحريض قوي من كيناز البروتين المنشط الكبدي AMP كما تم الكشف عنه من خلال زيادة مستويات الفوسفور على البروتين المنشط الكبدي AMP T172 مماثلة لتلك التي لوحظت في الجسم الحي.

في الواقع، خمس ساعات من 10 العلاج Micromolar Rotenone كان لها آثار مثبطة عميقة على تخليق البروتين الوليدة في الكبد المعالجة الأولية مقارنة مع خلايا التحكم غير المعالجة كما يتضح من تحليل تفاعل الربط الكيميائي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إعداد جميع الكواشف والتمهيد المطلوبة مقدمًا. مهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجال الفيزيولوجيا المرضية الأيضية الكبدية لاستكشاف الآلية الجزيئية لتنظيم بروتين الطاقة في السمنة وداء السكري من النوع الثاني في كبد الماوس الأولي المعزول.