السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الخاصة بالخلية إشارات في المشبك الثلاثية للحجاب الحاجز الماوس
October 4th, 2018
نقدم هنا بروتوكولا للكالسيوم في صورة إشارات في سكان أنواع الخلايا الفردية في الوصلات العصبية العضلية مورين.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال العصبي العضلي، مثل دور إشارات الكالسيوم في العضلات أو خلايا شوان استجابة لتحفيز الأعصاب. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المرء يمكن صورة تنشيط أنواع محددة من الخلايا استجابة لتحفيز الأعصاب. للبدء ، والحصول على الفئران المعدلة وراثيا ، وgenotype لهم كما هو مفصل في بروتوكول النص.
بعد القتل الرحيم، مقطع عبر عرضية عبر الحيوان بأكمله فقط تحت الكبد وفوق القلب والرئتين مع مقص استئصال الرحم. تشريح بعيدا الكبد والقلب والرئتين. الحرص على الحفاظ على طول العصب فيرينيك الذي هو طويل بما فيه الكفاية بحيث يتم رسمها في قطب شفط.
إزالة مزيد من القفص الصدري وعمود العمود الفقري، باستثناء التلال رقيقة حول الحجاب الحاجز. ضع الحجاب الحاجز وعينة العصب فيرينيك في أنبوب ميكروفوج مع محلول كريبس-رينغر الذي يحتوي على ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من البونغاروكسيوم ألفا المسمى بالفلورسنت. السماح للعينة لاحتضان في المحل لمدة 10 دقائق في الظلام.
باستخدام دبابيس minutien شل الحجاب الحاجز عن طريق تثبيته على طبق ستة سنتيمترات المغلفة مع هلام السيليكون عازلة ومليئة ما يقرب من ثمانية ملليلتر من محلول كريبس رينغر المؤكسج. ضع الطبق على مرحلة المجهر. ثم، perfuse الحجاب الحاجز مع أكثر كريبس-رينغر الحل في ثمانية ملليلتر في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
في التكبير أربع مرات، وذلك باستخدام ميكرومانبولاتور، تحريك القطب الشفط على العصب الظاهري الأيسر. تطبيق الشفط عن طريق سحب برميل من حقنة خمسة ملليلتر متصلة الأنابيب التي تعلق على القطب الشفط. تأكد من أن الحجاب الحاجز عقود استجابة لتحفيز هرتز واحد عن طريق فحص بصريا مع إضاءة برايتفيلد.
إذا لم يكن كذلك، ضبط الجهد عن طريق تحويل مقبض الجهد تدريجيا لتحقيق نبض فوقماكسيمال الذي يمكن التحقق من خلال الفحص البصري لانكماش العضلات. إذا لم تكن مرئية حتى الآن، تفجير العصب مع حقنة ومحاولة لرسم مرة أخرى عن طريق تطبيق الشفط. الآن، إيقاف perfusion لإضافة مثبطات الميوسين الخاصة بالعضلات BHC أو الجهد بوابة قناة الصوديوم خصم مو كونotoxin.
إعداد BHC قبل التخفيف عن طريق الأنابيب أربعة microliters من 200 ملليمولار الأسهم BHC في DMSO في ملليلتر واحد من حل كريبس رينجر. إزالة ملليلتر واحد من حل كريبس-رينجر من الطبق. ثم يضاف BHC المخففة مسبقا إلى الطبق.
بعد 30 دقيقة، قم بتشغيل تسريب محلول كريبس-رينغر الطازج لمدة 20 إلى 30 دقيقة أخرى. ارتداء القفازات، وإعداد القطب تسجيل عن طريق وضع الزجاج خيوط البورسليكات مع القطر الخارجي من ملليمتر واحد وقطر داخلي من 0.4 ملليمتر في سحب ميكروبليت. تشديد بطلب لتضييق عليه في الموقف وإغلاق باب السحب.
ثم قم ببرمجة الـ puller كما هو موضح في بروتوكول النص. بالنسبة للزنايات الجنينية، قم بقياس المقاومة باستخدام عناصر تحكم البرامج في مكبر الصوت. تأكد من أن المقاومة بالقرب من 60 ميغاهات، وللفراجات القديمة، 10 إلى 20 ميغاهات.
الآن، قم بتحميل قطب التسجيل بثلاثة كلوريد بوتاسيوم مُولّر. في 10 مرات التكبير، وانخفاض القطب في العضلات باستخدام ميكرومانيبولاتور الثاني على الجانب الآخر من المرحلة ككترود محفز. استخدام القدرة على الحصول على البيانات الكهربائية البرمجيات الانتظار حتى غشاء يستريح التغييرات المحتملة من صفر إلى ناقص 65 ملليفولت أو أقل.
تحفيز في هرتز واحد والتحقق من وجود العضلات العمل المحتملة عن طريق التحقق من إمكانات كبيرة التي معارض تجاوز متواضعة. لا تخلط بين التحف التحفيز مع إمكانية العمل. في 20 مرات التكبير تحديد موقع الفرقة لوحة نهاية في وسط العضلات من خلال البحث عن الفلورسنت المسمى البونغاروكسيين تقاطعات العصبية العضلية تحت الإثارة الضوء الأصفر الأخضر.
التحول إلى الإثارة الضوء الأزرق لاستجابات الكالسيوم صورة في العضلات, الخلايا العصبية الحركية, أو خلايا Schwann. في هذا المثال يتم التعبير عن 3 GCaMP في خلايا العضلات. إذا رغبت في ذلك، قم بإعداد مقسم الصورة مع مرشحات تمرير النطاق وتصفية حافة واحدة dichroic للتصوير الطول الموجي المزدوج.
إجراء التجارب مع شريط السطوع على شريط الجدول بحث تعيين إلى 110٪ من المستوى الذي مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا التعبير عن الأنسجة معارض التشبع في 20 مرة التكبير دون binning استجابة لكلوريد البوتاسيوم. سجل في 20 لقطة في الثانية الواحدة حتى لا تفوت أي أحداث سريعة. تحفيز مع 1-45 ثانية من 20 إلى 40 هيرتز من تحفيز الأعصاب عن طريق تقديم قطار من النبضات باستخدام قطب شفط وجمع استجابات الكالسيوم الفلورسنت الديناميكية في خلية واحدة فرعية مع الفلورسنت المسمى الفلورسنت ألفا bungarin إشارة الوصل العصبية العضلية.
ويمكن أيضا أن تضاف ناهضات الدوائية عن طريق تطبيق حمام أو عن طريق التسريب ويمكن جمع ردود الكالسيوم الفلورسنت دينامية في نفس الطريق. عندما يتم الانتهاء من التصوير أو التجارب الكهربائية الفيزيولوجية لأنه تم تحقيق النتائج المرجوة، ضخ المياه من خلال خطوط القذف وامتصاص الماء مرتين إلى ثلاث مرات من خلال قطب شفط لضمان أن الأملاح لا تتراكم. خريطة مكانية لاستجابات الكالسيوم خلية شوان لتحفيز العصب فينية WNT واحد GCaMP ثلاثة غشاء الماوس في ما بعد الولادة اليوم السابع تظهر قيدا على خلايا Schwann الطفيلية في تقاطع عصبي عضلي.
تم تصوير نفس الحجاب الحاجز بعد وضع العلامات مع تسمية الفلورسنت ألفا بونغاروكسيتين، الذي يربط لتمكين مستقبلات أستيل من تقاطع عصبي عضلي. كما تم تصوير نفس الحجاب الحاجز تحت إضاءة برايتفيلد لتوجيه قطب تسجيل إلى منطقة ما بعد الاشتباك العصبي في العضلات عن طريق التقاطع العصبي العضلي. يظهر هنا هو الترسيم المكاني للخلايا الملونة المبرمجة أو المناطق ذات الاهتمام التي اتخذت لتحليل عابري الكالسيوم الفردية.
خريطة مكانية من استجابات الكالسيوم الخلية العضلية من mth 5 GCaMP ثلاثة الحجاب الحاجز الماوس في P أربعة لتحفيز العصب في القرنية في وجود مثبطات myosin BHC يظهر استجابة في جميع أنحاء المنطقة بأكملها من جميع خلايا العضلات الحجاب الحاجز. في المقابل, تحفيز الحجاب الحاجز نفسه في وجود mu-conotoxin يسبب استجابة الكالسيوم المقيدة مكانيا في منطقة الوسيط لجميع خلايا العضلات الحجاب الحاجز الذي يتوافق مع مستقبلات الأستيل كولين مجموعة المخصب نهاية الفرقة. بعد هذا الإجراء يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية أو المناعة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل، ما هو الملف الشخصي الجزيئي للخلايا التي تم تحديدها بواسطة الفيزيولوجيا الكهربائية أو تصوير الكالسيوم؟
يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على استجابات سكانية من خلايا شوان والخلايا العضلية لتحفيز الأعصاب في الفئران الوليدية العادية. ويمكن أيضا أن تطبق على دراسة الفئران القديمة أو على دراسة الفئران التي تعبر عن الأمراض العصبية العضلية البروتينات المرتبطة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا لتصوير إشارات الكالسيوم في مجموعات خلوية معينة عند التقاطع العصبي العضلي في الفئران، بهدف التحقيق في دور ديناميكيات الكالسيوم في العضلات وخلايا شوانو أثناء تحفيز العصب.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الفيزيولوجيا الكهربائية
الخلفية
- فهم إشارات الكالسيوم ضروري لفك شيفرة وظيفة التقاطع العصبي العضلي.
- استجابات الكالسيوم في العضلات وخلايا شوانو أساسية للتقلص العضلي وتواصل الأعصاب.
- يتم استخدام الفئران المعدلة وراثيًا لتمييز ديناميكيات الكالسيوم في أنواع الخلايا المستهدفة.
- يمكن البروتوكول من التصوير في الوقت الحقيقي أثناء تحفيز العصب لتقييم الاستجابات الخلوية.
هدف الدراسة
- تصور إشارات الكالسيوم عبر أنواع الخلايا المختلفة عند التقاطع العصبي العضلي.
- استكشاف ديناميكيات التواصل الخلوي أثناء تحفيز العصب.
- تحليل الاستجابات المحددة للعضلات وخلايا شوانو للإشارات العصبية العضلية.
الطرق المستخدمة
- تستخدم الدراسة تقنيات التصوير الحي عند التقاطع العصبي العضلي باستخدام الفئران المعدلة وراثيًا التي تعبر عن مؤشرات الكالسيوم.
- تشمل التدخلات الرئيسية تحفيز العصب والتلاعب الدوائي لتقييم استجابات الكالسيوم.
- تتضمن الخطوات الحاسمة تحسين ظروف التروية ووضع الأقطاب لتسجيل الإشارات بدقة.
- يتم التصوير باستخدام الفلورة في ظروف ضوئية متفاوتة لالتقاط الاستجابات الخلوية الديناميكية.
النتائج الرئيسية
- كشف التصوير أن إشارات الكالسيوم تتركز في خلايا شوانو الطرفية المجاورة للالتقاطع وخلايا العضلات أثناء التحفيز.
- لوحظت ديناميكيات زمنية مهمة في استجابة الكالسيوم في كل من العضلات وخلايا شوانو، مما يشير إلى إشارات منسقة.
- سمح هذا النهج بتصور تفاعلات واستجابات خلوية محددة في ظل ظروف التحفيز.
الاستنتاجات
- تظهر هذه الدراسة طريقة قابلة للتطبيق للتحقيق في ديناميكيات إشارات الكالسيوم في العضلات والخلايا الدبقية عند التقاطع العصبي العضلي.
- تعزز النتائج فهم التوصيل العصبي العضلي والسلوك الخلوي أثناء الإشارات المثيرة.
- تمتد الآثار إلى فهم أفضل للآليات الخلوية الكامنة وراء الوظيفة العصبية العضلية وحالات المرض المحتملة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables cell-specific calcium signaling imaging at the neuromuscular junction, supporting target validation in neuromuscular disease models by isolating functional responses in defined cell populations. It provides quantitative, spatially resolved readouts that enhance predictive confidence in preclinical target engagement and pathway modulation studies. The approach supports mechanistic de-risking by linking nerve stimulation to cellular responses in muscle, motor neurons, and Schwann cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by imaging calcium dynamics in specific cell types in response to nerve stimulation.
- Operational Value: Supports functional target validation through cell-type-specific readouts of intracellular signaling.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking target modulation to measurable calcium flux in disease-relevant cell populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline calcium signaling in defined NMJ cell types.
- Operational Value: Enables assay standardization via dual-wavelength imaging of dynamic signals and static NMJ labels for internal normalization.
- Scalability: Supports platform reuse through adaptation to multiple GECIs or GEVIs for multiplexed target engagement profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase calcium signaling observations to preclinical validation in disease models expressing neuromuscular-associated proteins.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from muscle, neuronal, or glial contributions to NMJ dysfunction.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing cell-specific contributions to calcium signaling deficits in pathological contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and mechanistic insight in translational research.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating calcium responses to nerve stimulation in individual cell types.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, quantifiable calcium flux measurements synchronized with NMJ landmarks.
- Analytics: Provides dynamic fluorescence readouts and spatial maps that enable comparison of compound effects across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing longitudinal assessment of calcium signaling in aging or disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform adaptable to multiple transgenic indicators and pharmacological perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neuromuscular target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via internal NMJ referencing and controlled perfusion.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by isolating cell-specific signaling contributions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on cell-type-specific target engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic mouse handling, electrophysiology, and fluorescence microscopy.
- Depends on optical splitter systems, perfusion setups, and suction electrode stimulation equipment.
- Necessitates cross-team standardization for consistent NMJ identification and calcium indicator expression levels.
- Involves adaptation considerations when applying to different disease models or developmental stages.
- Limited by tissue viability duration and potential signal overlap in densely innervated preparations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Preparation of the Diaphragms and Phrenic Nerves from Transgenic Mice
1:27
Stimulation and Recording of the Muscle Action Potentials
4:49
Imaging of the Fluorescence of the Sample
6:33
Results: Nerve Stimulation-induced Ca2+ Responses in Populations of Schwann Cells or Muscle Cells of the Neonatal Mouse Diaphragm
8:03
Conclusion
