تحديد وتوصيف النسيجي، وتشريح للماوس الفصوص البروستاتا لفي المختبر كروي 3D نماذج الثقافة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في بدء نماذج الماوس المعدلة وراثيا من سرطان البروستاتا والتحقيق في آلية سرطان البروستاتا من خلال في التحليل في الجسم الحي وفي المختبر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحليل كامل لنموذج فأر سرطان البروستاتا ، على طول الطريق من تشريح الأنسجة إلى عزل الخلايا واستزراعها. بعد تعريض الجهاز البولي التناسلي، أو UGS، فهم بقوة المثانة البولية مع ملقط حادة المتوسطة، ورفع النظام بأكمله من البطن الماوس.

حرك زوجًا من المقصات تحت المثانة والبروستاتا وصولاً إلى العمود الفقري لإجراء شق من خلال الحبل الشوكي، وقطع من خلال أي اتصالات متبقية إلى تجويف البطن للسماح بإزالة UGS بالكامل. نقل UGS إلى طبق بيتري ستة سنتيمترات تحتوي على 2-6 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تحت مجهر تشريح. واستخدام زوج من ملقط غرامة ومقص microdissection لمسح بعناية كل من الدهون من الجانبين على حد سواء الظهرية والبطينة من نظام الأنسجة دون قص أي أنسجة البروستاتا.

عندما تم إزالة كل من الدهون، وسحب المثانة مع ملقط ومكوس المثانة في قاعدتها. وضع الجانب المتبقي من الأنسجة البطنية وعقد قناة واحدة ينتهي مع ملقط، اتبع السفينة إلى قاعدتها مع مقص ومكوس السفينة في قاعدتها. إزالة نفس السفينة على الجانب الآخر وإدراج ملقط بين الحياة المنوية والبروستاتا للسماح بالقنص من أي النسيج الضام المجاورة حسب الضرورة.

ثم تتبع vesicles المنوية إلى قاعدتهم في مجرى البول وإزالة الأوعية دون ثقب لهم. عندما تم إزالة كلا من حويصلات، وضع الجانب الظهري الأنسجة حتى فصوص الظهر التي تشبه أجنحة فراشة مرئية. عقد كل فص الظهر مع ملقط، وقطع الأنسجة في قاعدتها مع مقص لجمع الفصوص الظهرية وتحويل الأنسجة إلى الجانب البطني.

جمع فصوص الجانبية، والتي هي صغيرة وعادة ما التفاف مجرى البول على الجانب ويتم إسفين بين الفصوص الأمامية، البطنية، والضحلية بنفس الطريقة. جمع فصوص البطن، والتي هي أكبر من فصوص الجانبي والاستلقاء على مجرى البول البطين. ثم قطع والتخلص من مجرى البول لحصاد الفصوص الأمامية.

لمعالجة أنسجة البروستاتا لثقافة 3D، نقل الفصوص إلى طبق 10 سنتيمترا تحتوي على اثنين إلى ثلاثة ملليلتر من DMEM، واستخدام مشرط لتمرم أنابيب البروستاتا بدقة ونس قدر الإمكان. نقل شظايا الأنسجة إلى غطاء نقّام نسيج معقّم وإضافة محلول الأنسجة إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. جلب حجم في أنبوب يصل إلى تسعة ملليلتر مع المتوسطة الطازجة، وإضافة ملليلتر واحد من TenX الكولاجينازل حل الأسهم إلى خليط الأنسجة.

بعد دوامة، احتضان الأنبوب مع اهتزاز لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية لتحلل المصفوفة خارج الخلية. في نهاية الحضانة، وجمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في مليلتر اثنين من شرائط 05٪ الحارة في EDTA. بعد خمس دقائق من 37 درجة مئوية لتسهيل شق الخلية إلى الخلية والتصاقات من خلية إلى مصفوفة، استخدم رأس أنبوب P1000 مع طرف لوحة واسعة ل triturate الأنسجة ثماني إلى 10 مرات لتفريق أي كتل.

كرر الانفصال مع طرف P200 أنبوب الرأس. ثم تحييد التربسين مع ثلاثة ملليلتر من المتوسط الكامل. اخلط 500 وحدة من الحمض النووي DNASE1 في ملاط الأنسجة ومرر المحلل من خمس إلى عشر مرات من خلال حقنة من خمس ملليلتر مجهزة بإبرة من عيار 18، تليها خمس مرات من خلال إبرة من 20 مقياسًا.

عندما لا تكون هناك قطع الأنسجة الكبيرة مرئية، تصفية التعليق من خلال مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. لطلاء الخلية والثقافة، وإعادة تعليق بيليه في 0.5 ملليلتر من خلية ظهارية كاملة البروستاتا متوسطة النمو، وتلميح الخلايا إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من تركيز متوسط نمو الخلايا الظهارية البروستاتا. خلط الخلايا مع غشاء الطابق السفلي مصفوفة خارج الخلية في حجم اثنين إلى ثلاثة من نسبة الحل، وطبق تعليق الخلية في حاوية ثقافة الخلايا التجريبية المناسبة.

ثم ضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 دقيقة. عندما مصفوفة خارج الخلية قد توطدت، تغطية الثقافة مع ما قبل الدافئة كامل البروستاتا خلية ظهارية متوسطة النمو، مع الحرص على عدم إزعاج الغشاء السفلي مصفوفة خارج الخلية سد المكونات. ثم إعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة خمسة إلى 10 أيام ، منعش نصف الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام.

لحصاد المجالات، وpirate المتوسطة بعناية دون إزعاج الغشاء السفلي مصفوفة هلام المكونات، وإضافة ملليلتر واحد من حل Disbase ل100 ميكرولترات من غشاء الطابق السفلي مصفوفة خارج الخلية. باستخدام مكشطة الخلية، كشط على طول الجزء السفلي من لوحة لرفع الهلام الغشاء الطابق السفلي خارج الخلية من الجزء السفلي من لوحة في افرحة، والأنابيب حتى حل كامل مرة واحدة لتفريق المكونات إلى قطع أصغر. احتضان قطع المصفوفة الخلوية الإضافية في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعة إلى ساعتين حتى يذوب غشاء الطابق السفلي تماماً.

ثم نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر. وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمزيد من التلاعب المصب. تتكون البروستاتا الماوس من أربعة أزواج من الفصوص تقع dorsally وببطين إلى vesicles المنوية ومجرى البول.

تتكون فصوص البروستاتا من ملفات تعريف متعددة للغدة ، يتكون كل منها من تجويف ، وتحيط به خلايا ظهارية سرية. أشكال الفصوص ، وتنظيم الخلايا وطبيعة إفراز تختلف من الفص إلى الفص. خلايا البروستاتا المعزولة تبدأ في النمو في organoids في وقت مبكر من أربعة أيام بعد الغشاء السفلي ثقافة مصفوفة خارج الخلية.

على مدى الأيام القادمة إلى ستة أيام، تنمو معظم الخلايا في مجالات صلبة مع جزء من المجالات التي تظهر التجويف الجزئي أو الكامل. تظهر spheroids أيضًا تلطخ بيتا قوية في تقاطعات الخلايا إلى الخلية التي تشارك في التعريب مع تلطيخ F-actin. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدًا اتباع خطوات الميكروستيون بدقة.

على سبيل المثال، عزل فصوص البروستاتا بينما لا تزال تعلق على مجرى البول، حتى تعرف أي الفص الذي يستند إلى حيث هم فيما يتعلق مجرى البول. بعد إجراء التشريح، يمكن استخدام الفصوص المعزولة لتحليل المصب، مثل تسلسل RMA أو النشاف الغربي أو الكبت المناعي. تسمح لك تقنية الثقافة ثلاثية الأبعاد الأساسية بالحصول على مزيد من الرؤى حول آلية سرطان البروستاتا ، لأنه يمكنك مراقبة الحياة باستخدام الزفوات للتغيرات في مورفولوجيا والسلوك وتحديد أي تغييرات في الورم النورمي في نفس الشيء.

باختصار، يمكن أن تدمج هذه الأساليب التشريحية وثقافة البروستاتا لمختلف التطبيقات المصب لتوفير معلومات قيمة للتحقيق في آلية سرطان البروستاتا باستخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا.