العلاج الجيني بوساطة ناقلات لينتيفيرال من خلايا الكبد فيفو السابقين للزرع الذاتي في الخنازير

يهدف هذا البروتوكول لوصف تتمثل الخنزير العزلة و السابقين فيفو إيصال الجينات لعلاج نماذج لأمراض التمثيل الغذائي عن طريق زرع الخلايا ذاتي. على الرغم من أن هذا النموذج خاصة تتمتع بمزايا فريدة من نوعها لصالح العلاج الناجح، التطبيق مؤسسة ذات صلة لمعالجة أمراض إضافية والمؤشرات.

السابقين فيفو العلاج الجيني وزرع الخلايا الذاتية لعلاج الأخطاء غير مولود من التمثيل الغذائي في الكبد هو بديل مهم لعلاج هذه الاضطرابات. ويسمح لنا ليس فقط لعلاج هذه الاضطرابات، ولكن معرفة الكتلة الحيوية اللازمة لتكون قادرة على تحقيق نتيجة علاجية. هذا النهج يتجنب أيضا العواقب الهامة للكبت المناعي وغيرها من العواقب مع أنواع مختلفة من العلاجات.

في السياق الحالي، نحن نستخدم هذا النهج لعلاج التيروزين الدمية الوراثية نوع 1. ومع ذلك، فإن الفكرة هي أن هذا سيكون نهج منصة لعلاج العديد من أمراض الكبد المختلفة مع الحد الأدنى من التغيير. من المهم أن تكون قادرًا على تصور هذه التقنية لأن هناك بعض التقلبات عندما يتعلق الأمر بتصور كفاءة الضخ ، وهو أمر ضروري للحصول على خلايا الكبد القابلة للتطبيق للزرع.

إجراء العمليات الجراحية التي أجراها روبرت كايزر وجوزيف ليلغارد. عزل الخلية التي يؤديها زيجي دو، بروس أميوت. تم تنقية الخلايا UAU والخلايا الحية السابقة من الخلايا التي تم القيام بها من قبل كيتلين VanLith.

تم إعداد الحيوانات والإعدادية OR من قبل كاري ألن ولوري هيلين. لتنفيذ إدخال موقع الميناء الأولي، قم بإجراء تقنية هاسون المفتوحة إلى أومبيليكوس من تخدير، ما يصل إلى ثلاثة أشهر، كبيرة، خنزير مزرعة بيضاء. إدخال trocar 12 ملليمتر في تجويف البطن، حيث الصفاق مرئي.

عندما يكون التروكر في مكانه، مرر نطاق 30 درجة من 5 ملليمترات من خلال منفذ الدخول وينزّم البطن بثاني أكسيد الكربون إلى 15 ملليمترا من الزئبق. تحت التصور المباشر مع الكاميرا بالمنظار، ضع 2 منافذ إضافية 5 ملليمتر، والتثليث على الفص الجانبي الأيسر للكبد. ووضع منظار البطن في واحد من المنافذ الجديدة.

تحديد الجزء الجانبي الأيسر من الكبد عند نقطة الشق الرئيسي للفص الأيسر الذي يفصل بين الأجزاء الوسطية والشريحة الجانبي الأيسر. واستخدم دباسة جراحية لتأمين الهياكل الوعائية والوريد الكبدي على طول هذا الشق. Transect parenchyma من خلال هذا الشق باستخدام عمليات إطلاق متتالية و 60، 45، أو 30 ملليمتر أحمال الأوعية الدموية الطويلة.

عندما يكتمل ال استئصال، تقييم بقايا الكبد لضمان هدسات كافية واستخدام المسكات بالمنظار وكيس استرجاع الأنسجة بالمنظار لاسترداد قسم الكبد. الآن، قم بإزالة المنافذ واستخدم خياطة حجم صفر متقطع لفافية خط الوسط. خياطة 2-0 تشغيل لطبقة الجلد العميقة.

وخياطة 4-0 جارية للطبقة تحتية، لإغلاق شق منفذ 12 ملليمتر في الطبقات الثلاث. ثم أغلق المنافذ الخمسة ملليمتر في طبقة واحدة مع 2-0 الغرز. ووضع ضمادة معقمة على الشقوق.

لعزل الكبد، أولاً ربط مضخة مُتعالِيّة تُضَمّل لتقديم حلول التشتت، التي يتم الحفاظ عليها في حمام مائي 43 درجة مئوية، إلى القثطارات التي يجب وضعها في الأوعية الكبيرة المكشوفة لقسم الكبد. رئيس المضخة والأنابيب مع محلول اثنين من perfusion، ما يصل إلى موقف وقف الديك للتبديل بين الضخ واحد و perfusion تسليم حل اثنين إلى الأنسجة. والتبديل في وقف الديك إلى موضع واحد perfusion.

ثم رئيس بقية مجموعة أنابيب. ملء تماما فخ فقاعة مضمنة لمنع إدخال فقاعات الهواء في الأنسجة. بعد ذلك، قم بعمل شق مستعرض نظيف، عمودي على الدورة الدموية الكبدية للكشف عن المقاطع العرضية لأسعان الوريد المدخل والأوردة الكبدية للقسطرة.

واستخدم قسطرة مريحة لقسطرة الأوردة المتاحة المكشوفة. عندما تكون القسطرة في مكانها، اثقب أنسجة الكبد التي تم استئصالها مع التسريب الدافئ حل واحد بمعدل تدفق 100 ملليمتر في الدقيقة. نقل أنبوب المنفذ من الوريد إلى الوريد كل 30 إلى 60 ثانية.

وباستخدام أنبوب الإخلاء لإزالة العازلة الزائدة من علبة الأنسجة. بعد ركوب الدراجات في جميع الأوردة المتاحة لمدة 15 إلى 20 دقيقة، والتحول إلى التسريب حل اثنين في ظل نفس الظروف. باستخدام مضخة العودة لإعادة تدوير محلول الضخ الثاني إلى الخزان ، بمعدل تدفق أبطأ ، لإعادة الإدارة إلى الأنسجة.

تحقق من درجة حرارة سطح فخ فقاعة و, أو الكبد كل خمس دقائق تقريبا للتأكد من أن خلايا الكبد لا يحصلون على البرد. عندما يبيض الكبد بعد حوالي 30 دقيقة من الضخ ، قم بنقل الأنسجة إلى وعاء معقمة ، ملفوفة بأغطية معقمة ، ووضع الحاوية في غطاء لثقافة الخلية للحفاظ على العقم أثناء معالجة الكبد. يجب أن يتم عزل الكولاجين من خلايا الكبد وفك الخلية تماما حتى لا تحصل على تكتل الخلايا مما يقلل من صلاحية الخلايا وتواتر نقل.

غمر الكبد مع الكبد غسل المتوسطة وسحب مقص عبر الجزء العلوي من الأنسجة لتعطيل كبسولة الكبد. ارتداء قفازات معقمة، تدليك الكبد بلطف لإطلاق خلايا الكبد في الوسط. وتصفية الأنسجة فائقة، من خلال الشاش العقيم، في زجاجات أجهزة الطرد المركزي 200 ملليلتر.

جمع الكبدات المصفاة عن طريق الطرد المركزي. تجميع الخلايا في 150 ملليلتر من الكبد الطازج غسل المتوسطة في زجاجة واحدة 200 ملليلتر لغسل 2 إضافية. و بعد الخلايا بعد الطرد المركزي الثالث

ثم، تخفيف الخلايا إلى 1 مرات 10 إلى الخلايا الكبدية التاسعة لكل ملليلتر تركيز ملحي. لزرع تلقائي من خلايا الكبد المعزولة، استخدم محول ميغاهرتز اثنين-خمسة لتحديد الوريد المدخل عبر الموجات فوق الصوتية وتوجيه إبرة خمسة بوصة، 18 مقياس نحو الوريد المدخل الرئيسي، تقريبي إلى تشعب انها. تحميل الخلايا في حقنة 60 ملليلتر، وفقا لحجم الخلية الإجمالية وإرفاق الحقنة إلى الإبرة، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات.

بعد ذلك ، قم بالاكتئاب ببطء في المكبس المحاقن ليغرس يدويًا ما يصل إلى 1 مرة إلى 10 مرات إلى الخلايا الكبدية التاسعة من خلال الوريد البواب باستخدام قسطرة التسريب لمراقبة ضغط المسامية أثناء الزرع. عندما يتم تسليم جميع الخلايا، قم بإزالة القسطرة ومراقبة الوريد المدخل لوجود أحداث خثارية وتدفق أمامي عن طريق الموجات فوق الصوتية. في مجموعة تمثيلية من خمسة خنازير، خضع ذلك استئصال الكبد، وكان معظم الغلة من أكبر من 10 إلى الكبد التاسع مع ما يقرب من 80٪ قابلية البقاء.

توفير عدد كاف من الخلايا لأي نوع من التلاعب المطلوب، بما في ذلك العلاج الجيني. الثقافة اللاحقة للجزء غير المزروع من هذه الخلايا الكبدية المعدة، أظهرت قابلية جيدة للحياة والالتصاق مع مورفولوجيا الكبد نموذجية 46 ساعة بعد تحويلها والطلاء الأولي. يختلف النقّة الأولية حسب عدد الخلايا التي أعيد إدخالها أثناء عملية الزرع.

هذه الخزعات التمثيلية توضح جدولا زمنيا لتوسيع الخلايا المصححة بالجينات. فريدة من نوعها للأمراض, مثل التيروزينيميا الوراثية نوع 1, التي تتمتع ضغط مختارة إيجابية للخلايا السليمة. هذا التوسع هو عادة بعد 12 شهرا من زرع.

مرة واحدة في زرع fumary fumtoacetate المياه خروج المغلوب الحيوان قد حققت حوالي 20٪ إعادة السكان من الكبد تصحيحها داخل الكبد، ومستويات التيروزين سوف تطبيع بالمقارنة مع الحيوانات البرية من نوع. في حين أن الحيوانات غير المصححة تظهر ارتفاعًا كبيرًا في كل من فوسفاتاز القلوية وspartate transaminase مقارنة بالحيوانات البرية ، فإن العلاج الجيني السابق vivo يعيد مستويات إنزيمات المصل هذه إلى طبيعتها. علاوة على ذلك ، يتم تعطيل صحة الأيض في الكبد العام في خنازير الضربة القاضية غير المعالجة ، كما هو موضح في الارتفاعات في الأمونيا المتداولة التي يتم تصحيحها بعد إعادة التعداد مع خلايا الكبد المعالجة.

من المهم أن نتذكر مع استخدام هذه التقنية للتعامل مع الأنسجة والتلاعب بها بعناية وبزهر قدر الإمكان. زيادة التعامل مع أو التلاعب في الأنسجة، ويؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا وانخفاض العائد. ويمكن أيضاً أن ينطبق هذا النهج على الأشخاص المهتمين بدراسة توزيع القوس وعدم كفاءة الرسم البياني في تقنيات وضع العلامات، وذلك باستخدام تقنيات أخرى خارج بروتوكولات النقل الفيروسي.

لا تنسى أن العمل مع ناقلات الفيروسية يمكن أن تكون خطرة، وذلك باتباع إجراءات السلامة الحيوية المناسبة، فضلا عن ارتداء معدات الحماية الشخصية أمر ضروري عند استخدام هذه التقنيات.