نموذج رواية في المختبر للانفجار إصابات الدماغ الرضية

وتصف هذه الورقة نموذج رواية من إصابات الدماغ الرضية الانفجار الرئيسي. يتم استخدام أنبوب الهواء المضغوط صدمة مدفوعة لفضح في المختبر الماوس شريحة هيبوكامبال الثقافات إلى موجه صدمة واحدة. هذا بروتوكول بسيط وسريع توليد إصابة في أنسجة الدماغ استنساخه مع إنتاجية عالية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إصابات الدماغ الرضية الضارة ويمكن استخدامها لفحص الأدوية العصبية قبل استخدام أكثر تعقيدًا في نماذج Vivo. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم أداة مختبرية لتعريض أنسجة الدماغ في الجسم في المختبر إلى موجة صدمة باستخدام بروتوكول بسيط وعالي الإنتاجية الذي يسمح بإنشاء إصابة قابلة للاستنساخ. أولاً، أدخل حلقات صلبة مصنوعة خصيصاً في آبار طبق من ستة صحن.

ثم إضافة مسبق الدفء مصل خال من المتوسطة التجريبية مع يوديد بروبدييوم إلى الآبار ضمان أن مستوى المتوسطة لا تصل إلى أعلى درجة من الحلبة. نقل لوحة إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة لضمان أن المتوسطة هي في 37 درجة مئوية قبل أن يتم نقل إدراج ثقافة الأنسجة. بعد ساعة، نقل إدراج ثقافة الأنسجة مع شرائح organotypic من أطباق النمو على الحلقات في لوحة ستة جيدا.

جعل نقطة على حافة إدراج في وضع الساعة الثالثة مع قلم علامة دائمة لتسهيل إعادة إدراج إلى موقعها الأصلي، ثم تسمية كل لوحة ستة بئر مع اسم وتاريخ فريد من نوعه وجعل خريطة لآبار كل لوحة، وتسمية كل بئر مع حرف وكل شريحة في البئر مع عدد بحيث كل شريحة له معرف فريد من نوعه. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لضمان شرائح هي في 37 درجة مئوية مباشرة قبل التصوير. بعد ساعة واحدة من الانتقال إلى وسيط تجريبي، قم بتقييم صحة الشريحة عن طريق تصوير كل شريحة بشكل فردي وتسلسلي تحت طاقة منخفضة.

استخدم مجهر الفلوريسينس مزود بإثارة مناسبة ومرشح انبعاث مثالي في غرفة مظلمة أو غرفة ذات ضوء خافت. احتفظ بالغطاء على اللوحة عند التصوير. قد يتراكم بعض التكثيف على داخل الغطاء.

إذا حدث ذلك، استخدم مجفف شعر لفترة وجيزة على الإعداد المنخفض على السطح الخارجي للغطاء. تأكد من تطابق ظروف التصوير في أيام مختلفة وبين التجارب. في خط الأساس، تظهر شرائح صحية تلطيخ الفلورسنت القليل جدا.

الشرائح التي تظهر مناطق من تلطيخ أحمر كثيف تشير إلى قابلية للخطر وينبغي استبعادها من مزيد من التحليل. وللمقارنة، تظهر هنا الفلوريسنس من شريحة الانفجار المصابة في الساعة 72. مباشرة بعد التصوير، وإزالة واحد إدراج ثقافة الأنسجة من لوحة ستة جيدا ونقل بعناية إدراج إلى كيس البولي ايثيلين العقيمة التي تحتوي على 20 ملليلتر من المتوسطة التجريبية قبل الدافئة فقاعة مع 95٪ من الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

إزالة بعناية أي فقاعات الهواء وختم كيس معقمة عن طريق التواء أعلى وتطبيق المشبك البلاستيك. تأكد من أن كل كيس معقمة هو المسمى بشكل صحيح مع لوحة وتحديد جيدا. بعد نقل كل ثقافة الأنسجة إدراج إلى كيس معقمة الفردية، ووضع أكياس ولوحات الآبار الستة مع المتوسطة التجريبية في حاضنة درجة 37 درجة مئوية.

بعد ساعة واحدة، بعناية حزمة أكياس معقمة مع إدراج ثقافة الأنسجة في صناديق بلاستيكية داخل مربع منظم الحرارية مليئة المياه المؤينة في 37 درجة مئوية. وينبغي أن المياه إبقاء شرائح organotypic في درجة الحرارة الفسيولوجية في جميع أنحاء بروتوكول التعرض shockwave. ارتداء الأحذية الواقية الصلب، معطف المختبر، والقفازات أثناء إعداد أنبوب الصدمة والتعرض لالموجات الصدمة.

استخدم قضيبًا فارغًا لإرباس إطار حامل الحقيبة المعقم إلى شفة أنبوب الصدمة التي تضمن محاذاة الثقب المركزي مع مخرج أنبوب الصدمة. جهاز استشعار واحد، محول الضغط، ويقع في الجزء الأوسط من القسم مدفوعة، وجهاز استشعار اثنين هو في شفة من أنبوب الصدمة. قم بتوصيل محولات الضغط هذه بمنظار من خلال وحدة طاقة مصدرية حالية واطفئ منظار المنظار.

تأكد من إغلاق صمام اللولبي في أنبوب الصدمة والتحكم في التدفق، ثم افتح خط الهواء المضغوط الخارجي وشحن الصمام اللولبي إلى 2.5 بار. افتح صمام أمان اسطوانة الهواء المضغوطة وافتح ببطء منظم الضغط لزيادة الضغط إلى حوالي خمسة بار. المقبل، وإعداد الحجاب الحاجز عن طريق قطع 23 ميكرون أوراق البوليستر سميكة في 10 في 10 مربعات سنتيمتر.

إعداد مقابض من الشريط الأوتوكلاف والتمسك بها إلى أعلى وأسفل كل الحجاب الحاجز. ضع حجابًا واحدًا في الخرق وتأكد من أن تكون مركزة. بعد ذلك، المشبك الحجاب الحاجز باستخدام أربعة مسامير M24 والمكسرات.

أزياء لهم بالتتابع بطريقة متناظرة قطريا مع ضمان الحجاب الحاجز هي خالية من التجاعيد. المشبك كيس معقمة في وضع عمودي على إطار حامل ضمان أن سطح النسيج إدراج ثقافة مع شرائح فرس النهر organotypic تواجه منفذ أنبوب الصدمة وتتركز إدراج ثقافة الأنسجة داخل كيس معقمة. بالنسبة لتكوين الحجاب الحاجز المزدوج ، يعتمد ضغط الانفجار على فرق ضغط الغاز بين السائق وغرفة الاختراق المزدوج.

لذلك، للحصول على الحجاب الحاجز لتنفجر بطريقة تسيطر عليها، يتم فتح صمام الأمان خرق مزدوج يدويا بمجرد الوصول إلى الضغوط المستهدفة. وضع على المدافعين عن الأذن ونظارات السلامة إذا لم تكن ترتديه بالفعل. أغلق الصمام اللولبي.

قم بتشغيل وحدة الطاقة المصدر الحالية للحصول على بيانات الموجات المفاجئة. عالج مقبض التحكم في التدفق في لوحة التحكم في أنبوب الصدمة للضغط ببطء على قسم حجم السائق في أنبوب الصدمة لتكوين الحجاب الحاجز المفرد أو قسم حجم السائق وقسم الاختراق المزدوج من أنبوب الصدمة لتكوين الحجاب الحاجز المزدوج. بمجرد تمزق الحجاب الحاجز، سرعان ما أغلقت تدفق الهواء المضغوط باستخدام مقبض التدفق وفتح صمام اللولبي.

وينبغي أن يكون مزيج مثالي من معلمات موجة الصدمة كافية للتسبب في إصابة الأنسجة ولكن ليس عالية بحيث تسبب إدراج ثقافة الأنسجة أو تشوه كيس معقمة أو تمزق. بعد تعريض كل شريحة إلى موجة أنبوب صدمة واحدة، إعادتها على الفور إلى مربع منظم حراريًا. ثم تأخذ كيس معقمة المقبل من مربع وشبقع على إطار حامل.

قم بإجراء التبديل بسلاسة وسرعة لمنع تبريد الوسيط التجريبي حيث أن درجات الحرارة أقل من 37 قد تتداخل مع تطور الإصابات. مرة واحدة وقد تعرضت جميع إدراج ثقافة الأنسجة إلى صدمة أو بروتوكول صورية، والعودة إدراج ثقافة الأنسجة إلى آبارهم في صحن الستة الأصلية والعودة إلى الحاضنة حتى مزيد من التصوير. هذه الصورة هي مثال تمثيلي لـ shockwave تم الحصول عليها باستخدام 23 ميكرون فيلم البوليستر سميكة مع 55 كيلوباسكال الذروة الضغط الزائد.

وكانت سرعة الموجة الصادمة 440 مترا في الثانية. تسبب كل من 50 و 55 كيلوباسكال ذروة صدمة الضغط الزائد إصابة كبيرة التي وضعت في جميع أنحاء بروتوكول 72 ساعة بالمقارنة مع مجموعة صورية. وكانت الإصابة الناجمة عن ذروة التعرض لموجة الضغط الزائد التي تبلغ 55 كيلوباسكال أعلى بكثير من الإصابة بعد 50 كيلوباسكال في 48 ساعة و 72 ساعة، مما يدل على أن تطور الإصابة يتناسب مع شدة الموجة الصادمة.

تُظهر هذه الصورة شريحة بعد 72 ساعة من انفجار 50 كيلوباسكال. مستوى عال من الإصابة منتشر مرئيا. الإصابة أكثر وضوحا بعد انفجار 55 كيلوباسكال الضغط الزائد.

هذه الصورة الفلورية البوديدييوم يظهر شريحة organotypic من تجربة صورية. شريحة صور يظهر مستويات منخفضة من الفلوريسنس. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر للحفاظ على تقنية معقمة في جميع أنحاء لتجنب تلوث الأنسجة والتلاعب بثقافات الأنسجة بسرعة ولكن بلطف شديد لتجنب تلف الخلايا غير مقصودة.

بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تلطيخ الفلورة المناعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هي آليات موت الخلايا التي تنطوي عليها إصابات الدماغ الرضية الناجمة عن الانفجار؟ هذه التقنية تسمح فحص عالي الإنتاجية للباحثين في مجال الحماية العصبية لاستكشاف إمكانية الأدوية لمنع انتشار موت الخلايا وأنسجة الدماغ بعد التعرض لصدمة الانفجار.