رصد فرس النهر مما يشير إلى نشاط المسار باستخدام بيوسينسور القامع (لاتس لاتفيا) ورم كبير القائم على لوسيفراس

مختبري يدرس دور مسار فرس النهر في سرطان الثدي والرئة ، ومؤخرا ، قمنا بتطوير مستشعر حيوي جديد لمراقبة نشاط إشارات فرس النهر. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية حول شبكات الإشارات الخلوية ، مثل كيفية استجابة مسار فرس النهر للعوامل وكيفية تفاعله مع مسارات الإشارات الأخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي حساسيتها الكبيرة وأيضا يمكن معالجة العدد الكبير من العينات بسرعة وفي وقت واحد.

هذه التقنية لها تطبيقات متنوعة في البحث الأساسي والانتقالي للتحقيق في منظمات مسار إشارات فرس النهر في المختبر وفي الجسم الحي. للبدء ، قم ببلازميدات LATS-BS التحضيرية المصغرة الطازجة من الثقافة السائلة لبكتيريا DH5-Alpha. قبل ساعة من التعدي ، قم بشفط الوسط من اللوحة ، وأضف 500 ميكرولتر من وسط النمو إلى كل بئر.

إحدى النقاط المهمة هي أنه يجب تحضير المستشعر الحيوي LATS طازجا من أجل الحصول على أقصى قدر من التعبير والنشاط. أيضا ، يوصى دائما باستخدام منظم المنبع لمسار فرس النهر ، مثل MSD ، كعنصر تحكم إيجابي عند إجراء فحص لوسيفيراز. بعد ذلك ، أعد الخلايا إلى الحاضنة.

بعد ذلك ، قم بإعداد الحل أ ، وهو محلول الحمض النووي ، والمحلول B ، وهو كاشف تعداء مخفف قائم على البوليمر ، كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، أضف المحلول B على الفور إلى المحلول A ، وقم بتقطيع الماصة برفق لأعلى ولأسفل للخلط. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح بتكوين مجمعات التعداد.

ثم أضف الحجم الإجمالي لمجمعات التعدي بالتنقيط إلى كل بئر من اللوحة مع دوامة لطيفة. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسائط المحتوية على مركب التعداء واستبدلها بوسائط كاملة جديدة.

ثم قم بزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ليوم آخر. تمييع كمية مناسبة من 5x محلول التحلل السلبي بالماء المقطر. ثم ، استنشق الوسائط تماما من اللوحة.

أضف ملليلترا واحدا من PBS إلى كل بئر ، وقم بتدوير اللوحة برفق لإزالة الخلايا المنفصلة ووسائط النمو المتبقية. ثم استنشق PBS تماما. بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولتر من 1xPLB إلى كل بئر.

ضع لوحة الثقافة على منصة هزاز لمدة 15 دقيقة لضمان تغطية متساوية للطبقة الأحادية للخلية باستخدام PLB. بعد ذلك ، انقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. قم بإزالة LAR-2 من التخزين 80 درجة مئوية ، وقم بتوازنه مع درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإعداد كاشف الكشف عن Renilla لكمية مناسبة من المقايسات. أضف كاشف الكشف عن Renilla إلى ركيزة 50x والمخزن المؤقت الخاص به. بعد ذلك ، قم بتوزيع 10 ميكرولتر من كل خلية في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر.

بعد ذلك ، قم ببرمجة مقياس الإضاءة لإجراء تأخير ما قبل القياس لمدة ثانيتين ، متبوعا بفترة قياس مدتها 10 ثوان. بعناية ، انقل 20 ميكرولترا من كاشف LAR-2 إلى أنبوب واحد ، وقم بسحب الماصة بسرعة لأعلى ولأسفل للخلط. ثم ضع الأنبوب على الفور في مقياس الإضاءة وابدأ القراءة.

بعد القراءة ، قم بإزالة أنبوب العينة من مقياس الإضاءة ، وأضف 20 ميكرولترا من كاشف Renilla ، وقم بالماصة لأعلى ولأسفل للخلط. ثم ضع العينة في مقياس الإضاءة وابدأ القراءة التالية. أولا ، استزراع وفصل وعد ولوحة HEK293 الخلايا الإعلانية كما هو موضح في بروتوكول النص.

ثم ، قبل ساعة واحدة من التعداء ، قم بشفط الوسائط من اللوحة واستبدلها بخمسة ملليلتر من وسائط النمو الكاملة الطازجة. أخيرا ، أضف المحلول المخفف B إلى المحلول A ، وقم بالماصة لأعلى ولأسفل للخلط. بعد ذلك ، احتضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل إضافة الحجم الإجمالي لمجمعات التعدي إلى اللوحة ، مع الدوران برفق.

احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بعمل التربسين وعد الخلايا. لوحة 10 ، 000 إلى 20 ، 000 خلية في كل بئر من صفيحة 96 بئرا بحجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر من الوسائط لكل بئر.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا ليوم آخر. قبل ساعة إلى أربع ساعات من إجراء فحص لوسيفيراز ، أضف العوامل التي يحتمل أن تنظم مسار فرس النهر ، بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومولار لكل بئر. بعد ذلك ، قم بشفط الوسائط تماما من الخلايا واغسل الخلايا في كل بئر ب 100 ميكرولتر من PBS.

ثم أضف 20 ميكرولترا من PLB إلى كل بئر. ضع لوحة الثقافة على منصة هزازة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، انقل 20 ميكرولترا من كاشف LAR-2 إلى كل بئر من اللوحة ، وقم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل للخلط.

بعد ذلك مباشرة ، ضع اللوحة في مقياس إضاءة لقراءة اللوحة وابدأ القراءة. في الجزء الأول من هذا البروتوكول ، تم نقل LATS-BS مع جينات مختلفة لتقييم تأثيرها على نشاط LATS kinas. في البروتوكول الثاني ، تم نقل LATS-BS إلى HEK293-AD ، وتم تمرير الخلايا إلى ألواح 96 بئرا.

بعد 40 ساعة من التعدي ، تمت معالجة الخلايا بمنظمات جزيئات صغيرة مختلفة معروفة لإشارات فرس النهر ، متبوعة بفحص لوسيفيراز. عند تفسير نتائج هذه المقايسات ، تجدر الإشارة إلى أن البروتينات والعلاجات الدوائية قد تنشط مسارات التغذية الراجعة التي تؤثر على نشاط المستشعر الحيوي. ستكون هناك حاجة إلى مزيد من التجارب لتأكيد العلاقة بين المرشح ومسار إشارات فرس النهر.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، أو اللطخة الغربية ، للإجابة على أسئلة إضافية حول نشاط كيناز LATS. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا السرطان لاستكشاف ديناميكيات ونشاط مسار إشارات LATS kinase و Hippo في العديد من العمليات البيولوجية والكيميائية الحيوية. لا تنس أن أدوية الفحص يمكن أن تكون خطيرة للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.