جيل زرع الأنسجة البشرية الرئة 3D (3D-الصلب) للنمذجة المرض
فبراير 12, 2019
نقدم هنا، على بروتوكول لإعداد شرائح مملوءة [اغروس] البشرية دقة قطع الرئة من أنسجة المريض مستأصل مناسبة لتوليد الثقافات أنسجة الرئة 3D لأمراض الرئة البشرية النموذجية في الدراسات البيولوجية والطبية الحيوية.
هذه الطريقة تسمح التحقيق في الأنسجة البشرية الحية في هيكل 3D الطبيعية وتكوين لترجمة النتائج المختبرية الرئيسية في العلاجات المحتملة. هذه التقنية تمكن على وجه التحديد جيل الثقافات الأنسجة من استئصالها جراحيا أو explanted أنسجة الرئة البشرية لتصور عينات الفردية المريض أنسجة الرئة المتوفى. يمكن استخدام أنسجة الرئة الخالية من الأمراض كثقافات أنسجة ثلاثية الأبعاد للأمراض الرئوية السابقة مما يتيح تحليل الميكانيكا الباثومية المبكرة في دقة اصمانية عالية.
تبدأ من خلال وضع عينة الرئة ا لم اقطت في 15 ملليلتر من المتوسطة زراعة في طبق ثقافة معقمة 15 سنتيمترا وعلبة معدنية معقمة مغطاة في ورقة الأنسجة، وملء حقنة 30 ملليلتر مع 42 درجة مئوية منخفضة ذوبان نقطة agarose. إزالة المُنْزع من القسطرة الوريدية الطرفية وإرفاق القسطرة بحقنة 30 ملليلتر. تحديد 0.5 إلى 3 ملليمتر القطر قصبة في أنسجة التهوية في قسم سليم من الأنسجة، وأدخل بلطف الكانولا في قصبات بقدر الإمكان.
استخدام ملقط لضغط جدار القصبات حول المظلة، وقط مثالي أي الشريان الرئوي المجاورة في نفس الوقت، لختم القصبات حول المظلة واستخدام المشبك الجراحي لocclude أي خطوط الهواء الإضافية الأخرى، لمنع تسرب agarose. بعد ذلك ، استخدم الملباب لرفع أنسجة الرئة من طبق الثقافة ، واستخدام الحقنة لتسليم الأذروز يدويًا من خلال الـ canula ، لا يزيد عن 0.3 ملليلتر في الثانية. عندما يتم تعبئة أنسجة الرئة تماما دون الإفراط في تضخيم الأنسجة، على الفور إزالة المظلة ومشابك القصبات.
غمر الأنسجة في الثقافة المتوسطة في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لتسهيل صلابة agarose، وتكرار إجراء ملء agarose لأي فتحات إضافية bronchiole. ثم، قم بتخزين أقسام أنسجة الرئة المليئة بأكاروز في أربع درجات مئوية متوسطة حتى التقطيع. لدقة قطع تشريح الرئة، وتحديد المناطق المملوءة بقوة agarose داخل أنسجة الرئة، التي لا تنهار عندما ضغطت بلطف مع ملاقط ضد الجزء السفلي من طبق ثقافة الخلية.
مكوس كتلة 1 إلى 1.5 سنتيمتر مكعب من المنطقة المليء بقوة مع جانب واحد لا تزال مغطاة بالجنب، واستخدام الغراء سيانوكريلات لإرفاق الجانب الجمع من كل كتلة الأنسجة إلى حامل هزاز. شريحة الطريق كله من خلال كتلة الأنسجة الطويلة، حتى يتم ترك فقط اثنين إلى ثلاثة milometers من الأنسجة unsliced. باستخدام ملقط لنقل كل قسم 500 ميكرومتر في بئر واحد من اثني عشر بئرا لوحة تحتوي على زراعة المتوسطة، كما يتم الحصول عليها.
عندما تم تقسيم جميع الأنسجة، نقل العينات من كل بئر إلى أطباق ثقافة عشرة سنتيمترات الفردية ووضع خزعة أربعة ملليمتر اللكم متعمّد إلى السطح العلوي من شريحة الرئة قطع الدقة. ثم، تحريك اللكم في اتجاه عقارب الساعة وتناوب عكس عقارب الساعة، والحصول على اللكمات الأنسجة من عينة الرئة. وضع كل لكمة في ثقافة الخلية الطازجة المتوسطة في الآبار الفردية من لوحة 96-جيدا كما يتم الحصول عليها.
عندما تم الحصول على جميع اللكمات الأنسجة، ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة تصل إلى خمسة أيام. يسمح علم المناعة في الخلايا الليفية في نواة الخلية باستخدام الفلورس المناعي في ثقافات أنسجة الرئة ثلاثية الأبعاد البشرية بتصوير الهيكل السنخي المحفوظ السابق. علاج الدقة البشرية قطع اللكمات شريحة الرئة مع كوكتيل السيتوكين profibrotic لمدة 48 ساعة النتائج في التغيرات الشبيهة بالتليف في الثقافات البشرية 3-D أنسجة الرئة, بما في ذلك التعريفي كبيرة من المكونات المصفوفة خارج الخلية ذات الصلة, الكولاجين نوع واحد, وجينات فيبرومينكتين.
بالإضافة إلى ذلك, مستويات البروتين من vimentin علامة mesenchymal يتم تنظيمها في ثلاثة من أصل أربعة مرضى بعد علاج اللكمات 3-D أنسجة الرئة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحليل الحمض النووي الريبي عن طريق PCR في الوقت الحقيقي الكمي، أو تحليل البروتين عن طريق النشاف الغربي، لتقييم التعبير الجيني والبروتيني على التوالي داخل الأنسجة. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث في مجال علم الرئة التجريبي ، لـ explant lung biology وكذلك لإجراء دراسات سمية وأدائية في عينات الأنسجة البشرية.
تذكر أن الأنسجة البشرية الحية يحتمل أن تكون معائية وأن التدابير الوقائية مثل استخدام معدات الحماية الشخصية وتخزين الأنسجة المناسبة والنقل والمناولة النفايات، ينبغي اتخاذها دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لتحضير شرائح رئة بشرية مقطوعة بدقة ومملوءة بالأغاروز من أنسجة مستأصلة من المرضى. وتعد هذه الشرائح مناسبة لإنشاء مستنبتات ثلاثية الأبعاد لأنسجة الرئة لنمذجة أمراض الرئة البشرية في الدراسات البيولوجية والطبية الحيوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الأبحاث الطبية الحيوية
- نمذجة أمراض الرئة
- تقنيات زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد
خلفية علمية
- يمكن استخدام أنسجة الرئة البشرية لدراسة الأمراض ضمن بنية ثلاثية الأبعاد طبيعية.
- تتيح هذه الطريقة تصور عينات الرئة الخاصة بكل مريض على حدة.
- كما تمكن من تحليل الآليات المرضية المبكرة بدقة زمانية ومكانية عالية.
- تعد التدابير الاحترازية ضرورية نظراً للطبيعة المعدية للأنسجة البشرية الحية.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لإنشاء مستنبتات ثلاثية الأبعاد لأنسجة الرئة.
- تسهيل دراسة أمراض الرئة خارج الجسم (ex vivo).
- تمكين تحليل التعبير الجيني والبروتيني في أنسجة الرئة البشرية.
الطرق المستخدمة
- تحضير عينات أنسجة الرئة باستخدام أغاروز منخفض درجة الانصهار.
- التقطيع الدقيق لمقاطع الرئة المملوءة بالأغاروز.
- تقنيات الوسم المناعي لتصوير بنية الأنسجة.
- تحليل التعبير الجيني والبروتيني باستخدام PCR واللطخة الغربية (western blotting).
النتائج الرئيسية
- تحفيز تغيرات شبيهة بالتليف في مستنبتات أنسجة الرئة بعد العلاج بالسيتوكينات.
- زيادة تنظيم جينات الكولاجين من النوع الأول (Type One) والفيبرونيكتين.
- ارتفاع مستويات بروتين فيمنتين، وهو واسم ميزنكيمي، في العينات المعالجة.
- إمكانية إجراء مزيد من الأبحاث في مجالي علم الرئة التجريبي وعلم الأدوية.
الاستنتاجات
- تعزز هذه التقنية فهم بيولوجيا الرئة.
- توفر منصة لإجراء الدراسات السمية والدوائية.
- يمكن للأبحاث المستقبلية الاعتماد على هذه الطريقة لتحسين نمذجة الأمراض.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
توفر مستنبتات أنسجة الرئة البشرية ثلاثية الأبعاد والمشتقة من شرائح الرئة المقطوعة بدقة نموذجاً خارجياً (ex vivo) ذا صلة فسيولوجية لدراسة آليات المرض واستجابات الأدوية في بنية الأنسجة البشرية الأصلية. ويدعم هذا النهج التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية من خلال تمكين التقييم المباشر لتأثيرات المركبات في عينات الرئة المصابة أو المحيطة بالأورام من المرضى الأفراد. كما يعزز هذا النموذج الثقة التنبؤية في التقييم قبل السريري من خلال الحفاظ على التنوع الخلوي، وتكوين المصفوفة خارج الخلية، والخصائص الميكانيكية الحيوية الضرورية للأهمية الانتقالية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية في أنسجة الرئة البشرية السليمة مع الحفاظ على البنية ثلاثية الأبعاد وتنوع أنواع الخلايا.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال قياس التغيرات الناجمة عن العقاقير في المؤشرات الحيوية المرتبطة بالتليف، مثل collagen Type I وfibronectin.
- القيمة العلمية: تسهل توضيح المسارات من خلال التحليل المكاني الزماني للآليات المرضية المبكرة في الأنسجة البشرية ذات الصلة بالمرض.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: إنتاج عينات نسيجية مثقوبة معيارية وقابلة للتكرار، مناسبة لفحص المركبات باستخدام الأطباق متعددة الآبار.
- القيمة التشغيلية: تتيح الحصول على قراءات كمية عبر التألق المناعي، وqPCR، واللطخة الغربية (western blotting) لتحليلات الاستجابة للجرعة والمسار الزمني.
- القيمة العلمية: زيادة إنتاجية الأنسجة من عينات المرضى المحدودة من خلال ثقب الخزعة، مما يحسن من قابلية توسيع المقايسة وقدرة التكرار.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: ينمذج العمليات التليفية الخاصة بالبشر على المستويات دون الخلوية باستخدام تغيرات شبيهة بالتليف مستحثة بالسيتوكينات في شرائح رئة مقطوعة بدقة.
- القيمة التشغيلية: يوفر نظاماً ذا صلة بالمرض لتقييم ارتباط الهدف وآلية العمل في الأنسجة البشرية قبل إجراء الدراسات الحية (in vivo).
- القيمة العلمية: يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال السماح بربط القراءات الجزيئية بالنتائج الوظيفية على مستوى النسيج.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءًا من الاختبارات الأولية لفرضيات الأهداف، مرورًا بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى التحقق من الصلاحية قبل السريرية، مما يتيح التحسين التكراري استنادًا إلى استجابات الأنسجة البشرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال السماح بتصور بنية السنخ والاستجابات الخلوية في مستأصلات الرئة البشرية السليمة.
- الفحص: توفر عينات نسيجية مثقوبة جاهزة للمقايسة وبحجم وحيوية متسقين لفحص مكتبات المركبات في تنسيقات ذات 96 بئراً.
- التحليلات: تتيح قراءات متعددة تشمل التعبير الجيني (qPCR)، ومستويات البروتين (western blot)، والتصوير البنيوي (immunofluorescence) لمقارنة ظروف المعالجة.
- الأبحاث الترجمية: تربط بين مرحلة الاكتشاف والعمل قبل السريري من خلال الحفاظ على تعقيد الأنسجة البشرية وتمكين تحليل الاستجابة المصنفة حسب المرضى.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لنمذجة أمراض الرئة يمكن تطبيقها عبر مشاريع ومجالات علاجية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من دقة التنبؤ من خلال تقليل الفجوات في ترجمة الأنواع عبر الاستخدام المباشر لأنسجة الرئة البشرية.
- القيمة التشغيلية: توحد معايير تحضير الأنسجة من خلال التضمين في الأجاروز والتقطيع الدقيق، مما يحسن من إمكانية تكرار النتائج عبر المستخدمين والمواقع المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تدعم قرارات المضي قدماً أو التوقف عن طريق توفير إشارات مبكرة حول الفعالية والسمية بناءً على الأنسجة البشرية.
- التأثير على محفظة المشاريع: تتيح تحديد أولويات المركبات بناءً على تقييم المخاطر، وذلك استناداً إلى التأثيرات الميكانيكية في عينات الرئة البشرية المصابة بالأمراض أو المحيطة بالأورام.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الأنسجة البشرية، والتقنيات المعقمة، والتقطيع باستخدام المقطاع الاهتزازي (vibratome).
- يعتمد على توفر أنسجة رئة مستأصلة جراحيًا وأجاروز منخفض درجة الانصهار للحفاظ على البنية الهيكلية.
- يستلزم ظروف زراعة موحدة وضوابط لمنع التلوث نظرًا لاحتمالية وجود مسببات عدوى في الأنسجة البشرية الحية.
- يتضمن تحسين حجم خزعة المخرزة (biopsy punch) وتقنية التدوير لضمان تجانس العينات عبر المكررات.
- يتقيد بالنافذة الزمنية لحيوية الأنسجة، مما يتطلب المعالجة وبدء الزراعة في وقت سريع بعد الاستئصال.
