دراسة البروتين استيراد المعايشة باستخدام بروتوبلاستس
ديسمبر 10, 2018
هنا يصف لنا وضع بروتوكول للتعبير عن البروتينات في بروتوبلاستس باستخدام أسلوب التحويل شماعة بوساطة. يوفر الأسلوب التعبير سهلة للبروتينات للفائدة، وتحقيق كفاءة الترجمة البروتين وعملية الاستيراد لمختلف الظروف التجريبية المجراة في.
هذا اللغز يمكن أن تساعد في الإجابة على بعض الأسئلة في مجال بيولوجيا الخلية مثل البروتين المدخلات في الكلوروبلاست. والميزة الرئيسية لهذه التكنولوجيا هي أن مدخلات البروتين في الكلوروبلاستس يمكن أن تدرس في ظروف الجسم الحي. إثبات الإجراء سيكون جونهو لي وهيانغجو كانغ، اثنين من خارج وظيفة من مختبري.
للبدء، حصاد أنسجة أوراق سليمة من النباتات التي يبلغ عمرها أسبوعين من واحد إلى اثنين من لوحات B5. استخدام سكين الجراحية لحصاد الأوراق ووضعها في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر تحتوي على 25 ملليلتر من محلول انزيم. ضع الأنبوب أفقيًا على شاكر دوار وحضن بالتحريض اللطيف عند 22 درجة مئوية في الظلام لمدة ثماني إلى 12 ساعة حتى تبقى السيقان والسيقان فقط في الحل.
بعد الانتهاء من الحضانة، فلتر محلول الإنزيم الذي يحتوي على البروتبلاستس المفرج عنه من خلال شبكة بحجم مسام 140 ميكرومتر في طبق بيتري جديد. ثم طبقة بعناية الحل على رأس 15 ملليلتر من محلول السكروز 21٪في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. الطرد المركزي الأنبوب في الدوار دلو يتأرجح في 98 gs لمدة 10 دقائق مع أدنى إعدادات التسارع والتباطؤ.
بعد ذلك، استخدم ماصة باتورا لإزالة بعناية الضمورات من الطبقة العليا التي تحتوي على محلول الإنزيم ومن الواجهة بين محلول الإنزيمات وحل السكروز. نقل هذا الحل إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر يحتوي على 30 ملليلتر من محلول W5 وعكس أنبوب لخلط. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 51 gs لمدة ست دقائق.
استخدام ماصة لتجاهل هذا افرا بعناية دون إزعاج protoplasts في بيليه. إضافة 25 ملليلتر من حل W5 وبلطف إعادة تعليق الضمور. لتحقيق الاستقرار، احتضان في ثلاجة أربعة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
بعد أربع درجة مئوية الحضانة، بيليه الدمج تماما عن طريق الطرد المركزي لهم في 46 غرام لمدة دقيقتين. بعناية إزالة supernatent تماما وإضافة حل MANG إلى بيليه protoplast لتحقيق خمس مرات عشرة إلى ستة لكل ملليلتر. استخدام ماصة لإضافة 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما و 300 ميكرولترات من محلول بروبلاست إلى أنبوب جديد 13 ملليلتر جولة القاع.
مزيج عن طريق تناوب بلطف الأنابيب باليد ثم تضاف على الفور 300 ميكرولترس من الطازجة أعدت 40٪ PEG الحل. تخلط تماما عن طريق إمالة الأنبوب أفقيا تقريبا وتناوب عليه لطيف عدة مرات باليد. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
ثم تضاف ملليلتر واحد من حل W5 ومزيج تماما عن طريق تناوب بلطف الأنبوب باليد كما كان سابقا. احتضان العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر مرتين مع إضافة أول 1.5 ملليلتر ثم مليلترين من W5 وبعد الجمع النهائي والاختلاط، احتضان لمدة 30 دقيقة.
الطرد المركزي الأنبوب في 46 gs لمدة أربع دقائق ومن ثم التخلص من الفائق. إضافة ملليلترين من حل W5 إلى بيليه ومزيج بلطف، ولكن تماما، بنفس الطريقة كما كان سابقا. احتضان في 22 درجة مئوية في غرفة مظلمة لمدة 18 ساعة.
لتحليل استيراد البروتين باستخدام المجهر فلوريسكنس، استخدم ماصة مع طرف مشذب لوضع 10 ميكرولترات من محلول الوُرُب على شريحة زجاجية. استخدم زلة غطاء لتغطية الحل بعناية لتجنب إتلاف الوُرُب البروتبلاست. ضع الشريحة على خشبة مسرح المجهر الفلوري مع مرشح القبول الإثارة التي تم تعيينها لمراقبة البروتين الفلورسنت الأخضر و chlorophyll autofluorescence.
استخدام جهاز زوجين تهمة تبريد الكاميرا لالتقاط الصور ومعالجتها باستخدام برنامج تحرير تخيل لإنتاج الصور الملونة الزائفة. لاستخراج البروتين الكلي والتنقية المناعية، وإزالة ملليلتر واحد من محلول بروبلاست وخلط المليلتر واحد المتبقية. نقل هذا الحل بروبلاست إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 46 gs لمدة أربع دقائق.
إزالة فائقة بعد الانتهاء من الطرد المركزي وإضافة 80 ميكرولترات من عازلة denaturation. دوامة بقوة لمدة خمس ثوان. إضافة خمسة XDS عينة العازلة، مزيج جيدا ويغلي لمدة 10 دقائق لdenature.
تابع صفحة STS القياسية والتنقية المناعية مع الأجسام المضادة لـ GFP. RbcS وTGFT، وهو بناء الانصهار ترميز 79 بقايا الأحماض الأمينية الطرفية من RBCS التي تحتوي على ببتيد العبور تنصهر في GFP، واستخدمت لدراسة استيراد البروتينات إلى البلاستكات الكلورية عن طريق المجهر فلوريسكنس ومناعة. عند فحصها بواسطة المجهر فلوريسنس، إشارات الفلورسنت الخضراء من البروتين المستهدف دمجها مع إشارات الفلورسنت الحمراء من فلورورس الكلورو تشير إلى استيراد البروتين إلى البلاستيدات الكلورية.
بعد عزل البروتين الكلي ، لوحظ اثنين من نطاقات البروتين في مناعية ، وتبين أن البروتين تم استيرادها بشكل صحيح في الكلوروبلاست. ويتوافق النطاق العلوي مع السلائف الطول الكامل والفرقة السفلية إلى النموذج المجهز بعد الاستيراد إلى chloroplasts. زادت كمية الشكل المجهز للبروتين بطريقة تعتمد على الوقت ، مما يشير إلى أن البروتين يتم استيراده إلى الكلوروبلاست.
في هذا التطور، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا لاستكشاف البروتين متعبة أو خيط غشاء قطف في Arabidopsis.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة تحول بوساطة PEG للتعبير عن البروتينات في البراتوبلاستات، مما يسمح بدراسة توطين البروتين وعمليات الاستيراد في الجسم الحي. يتم توضيح البروتوكول بواسطة Junho Lee و Hyangju Kang، مما يوفر رؤى حول إدخال البروتين إلى البلاستيدات الخضراء.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- بيولوجيا النبات
- تعبير البروتين
الخلفية
- فهم توطين البروتين أمر بالغ الأهمية في بيولوجيا الخلية.
- تلعب البلاستيدات الخضراء دورًا مهمًا في التمثيل الغذائي للنباتات.
- دراسة عمليات استيراد البروتين يمكن أن تزيد من معرفتنا بالوظائف الخلوية.
- التحول بوساطة PEG هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع للبراتوبلاستات.
غرض الدراسة
- لتوفير بروتوكول للتعبير عن البروتينات في البراتوبلاستات.
- للتحقيق في توطين البروتين في ظروف الجسم الحي.
- لتسهيل البحث في عمليات استيراد البروتين في البلاستيدات الخضراء.
الطرق المستخدمة
- حصاد أنسجة الأوراق السليمة من نباتات عمرها أسبوعين.
- استخدام سكين جراحي لتحضير عينات الأوراق.
- حضانة أنسجة الأوراق في محلول إنزيم لعزلة البراتوبلاستات.
- استخدام التحول بوساطة PEG للتعبير عن البروتين.
النتائج الرئيسية
- التعبير الناجح عن البروتينات في البراتوبلاستات.
- تحقيق فعال في توطين البروتين.
- توضيح البروتوكول بواسطة الباحثين المدربين.
- رؤى حول عملية استيراد البروتينات إلى البلاستيدات الخضراء.
الاستنتاجات
- طريقة التحول بوساطة PEG فعالة للتعبير عن البروتين.
- هذا النهج يسمح بدراسة ديناميات البروتين في الجسم الحي.
- يمكن للبحوث الإضافية توسيع آثار استيراد البروتين في البلاستيدات الخضراء.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding protein import mechanisms into chloroplasts provides foundational insights for target validation in plant-based bioproduction systems. This protoplast-based assay enables mechanistic de-risking of nuclear-encoded protein trafficking pathways, supporting predictive confidence in chloroplast engineering for therapeutic protein expression. The method offers a disease-relevant system for evaluating targeting signal functionality and import efficiency under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates chloroplast targeting signal functionality and import kinetics for nuclear-encoded proteins.
- Operational Value: Enables rapid assessment of protein localization using fluorescence microscopy and immunoblotting readouts.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of transit peptide efficacy and import machinery engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative immunoblot data showing precursor-to-processed protein conversion over time.
- Operational Value: Provides a reproducible protoplast isolation and transfection workflow using PEG-mediated transformation.
- Assay Readiness: Delivers dual-readout capability (fluorescence and immunoblot) for import validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage targeting signal analysis to preclinical evaluation of chloroplast-expressed biologics.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein accumulation results from proper import versus cytosolic aggregation.
- Predictive Confidence: Time-dependent increase in processed protein band correlates with functional import progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target validation precedes lead identification, particularly for chloroplast-directed expression systems. It supports screening campaigns by providing import-competent biological systems ready for effector protein testing. Analytics derived from the assay include fluorescence co-localization metrics and immunoblot-based quantification of import efficiency.
- Discovery Biology: Tests whether candidate proteins achieve proper subcellular localization via endogenous import pathways.
- Screening: Delivers standardized protoplast preparations suitable for high-content localization screening.
- Analytics: Enables quantification of import kinetics through precursor/product band ratios in immunoblots.
- Translational Research: Informs construct design for chloroplast expression vectors by validating transit peptide functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple targeting signals across protein therapeutics candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein targeting hypotheses through direct visualization of import.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable protoplast isolation protocol with defined centrifugation and resuspension steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for chloroplast expression constructs by confirming import competence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targeting sequences based on empirical import data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant protoplast isolation, PEG-mediated transfection, and fluorescence microscopy.
- Dependent on enzymatic tissue digestion equipment, sucrose gradient centrifugation, and PEG solution preparation.
- Necessitates standardization of protoplast density (5×10⁶/mL) and DNA input (10 µg) for reproducible expression.
- Involves adaptation considerations when extending to non-Arabidopsis species or alternative chloroplast transformation systems.
- Practical limitations include protoplast viability window post-isolation and sensitivity to osmotic stress during PEG incubation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Protoplast Isolation
2:19
Protoplast Transformation using Polyethylene Glycol
3:53
Analysis of the Protein Import into Chloroplasts
5:10
Results: Fluorescence Microscopy and Immunoblotting to Analyze the Import of Proteins into Chloroplasts
6:07
Conclusion
