البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تفاعلات البروتين البروتين من خلال تمكين الكشف عن شركاء ملزمين رواية للبروتينات خارج الخلية، سواء في الإنتاجية العالية ومع حساسية عالية. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه مع بضعة ميكروغرام من البروتين، يمكنك توليد مئات الشرائح باستخدام طابعة الصفيف الصغير. استخدم صفيف صغير قياسي لطباعة الشرائح.

هذا الصك لديه قدرة 57 الشرائح لكل تشغيل، ويستخدم رأس الطباعة عقد 48 دبابيس اكتشاف، ويمكن أن تستوعب ما يصل إلى 8،000 البقع في كل شريحة. توليد لوحات العمل باستخدام 384 لوحات البئر في 10 ميكرولترات من عينة في بئر من لوحات الأسهم. تنفيذ هذه الخطوة يدوياً، قبل طباعة الشريحة باستخدام الصفيف الصغير.

ثم البروتينات بقعة مع نوع ريشة اكتشاف دبابيس على الشرائح سيلاني الايبوكسي في 60٪ الرطوبة لمنع جفاف بقع البروتين. يمكن رصد Cy3 المسمى الألبوم المصل البقري في مكررة بين كل عينة البروتين لتصور مجموعة لتركيب قناع. بعد الطباعة، قم بإزالة شرائح الصفيف الصغير البروتيني من البيئة المرطبة.

بعد ذلك ، استخدم جهاز ضباب بالموجات فوق الصوتية لتوليد ضباب ناعم من حل الحجب الذي يستقر على سطح الشريحة. ثم، كتلة الشرائح بين عشية وضحاها مع 5٪ من الحليب في PBST لسن السطح. تخزين الشرائح في ناقص 20 درجة مئوية في 50٪ الجلسرين لمنع التجمد.

غالباً ما تتميز التفاعلات بين البروتينات خارج الخلية بتقارباتها المنخفضة. لتمكين الكشف عن هذه التفاعلات، من خلال زيادة تعطش ملزمة، وضعنا نهجا متعدد التكافؤ على أساس التقاط البروتين المُسَلَف الذي تم التعبير عنه كـ FC الموسومة بالمجالات خارج الخلية على البروتين A الخرز الصغير المغلف. تدور الناقل IgG، التي تم المسمى مع Cy5 أحادية التفاعلية صبغة كما هو موضح في بروتوكول النص.

لحساب نسبة المول للبروتين الاستعلام و Cy5 IgG، تقسيم الوزن الجزيئي للبروتين الاستعلام على الوزن الجزيئي للIgG وضرب 40 ميكروغرام لكل ملليلتر لتحديد تركيز Cy5 IgG اللازمة. مرة واحدة وقد تم تحديد جميع النسب شكل مجمع البروتين الخرزة الصغيرة من خلال الجمع بين الاستعلام FC الموسومة و Cy5 IgG مع البروتين الخرز الصغير. اخلطي التعليق في برنامج تلفزيوني على دوار أنبوب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومحمية من الضوء.

لبدء الفحص، تدفئة الشرائح المعدة في درجة حرارة الغرفة قبل التحميل على محطة التهجين. لإجراء الفرز، أولا غسل مجموعة صغيرة مع PBST لمدة دقيقة واحدة لإزالة الجلسرين المتبقية. تحميل 200 ميكرولترات من واحد ملليغرام لكل ملليلتر بروتين A في برنامج تلفزيوني 5٪ الحليب واحتضان لمدة 30 دقيقة لمنع البروتين غير مُجمّع الخرز الصغير من ملزمة للبروتينات الموسومة FC التي قد تكون موجودة في مجموعة صغيرة.

بعد محطة التهجين يغسل الشرائح مع PBST، تحميل 200 ميكرولترات من مجمع حبة صغيرة الاستعلام، في وجود ملليغرام واحد لكل ملليلتر البروتين A واحتضان لمدة 30 دقيقة. بعد التهجين وغسل الشرائح من قبل محطة التهجين، شطف الشرائح بالماء ووضعها في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر الفردية. جفف الأنابيب عن طريق الدوران بمعدل 900 مرة G لمدة خمس دقائق.

وأخيرا، قم بمسح الشرائح باستخدام ماسح ضوئي للصفيف الصغير مناسب للكشف عن Cy3 و Cy5 fluorescence بواسطة 532 و 635 نانومتر على التوالي. تظهر هنا صورة تمثيلية لشريحة مطبوعة. وCy3 المسمى البوفين المصل بقع الألبومين في الأخضر.

وطُبعت هذه البقع في شكل نسخة مكررة باعتبارها مراقبة لجودة عملية الطباعة. تظهر هنا النتائج التمثيلية للبروتين اليتيم، الذي تم فحصه لتحديد شركاء الربط باستخدام تقنية الصفيف البروتيني الصغير خارج الخلية. يتم تحديد النقاط الحمراء المكررة كضربة لبروتين الاستعلام الذي تم فحصه.

هذه الطريقة التي يتم وصفها هي تنوعا للغاية ويمكن استخدامها لطباعة سلسلة من المكتبات البروتين، ما إذا كانت الأسر البروتين محددة أو مجموعات كبيرة من البروتينات مثل لنا. يمكن تقييم أي بروتين من الفائدة. في أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم التعامل مع الشرائح بعناية والتأكد من أنها لا تجف لمنع فقدان نشاط البروتينات المطبوعة.

بعد شاشة البروتين من الفائدة، ينصح بشدة للتحقق من صحة أي يضرب لوحظ باستخدام تقنيات متعامد، مثل الرنين البلازمون السطحي. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة تفاعلات البروتين خارج الخلية في البشر.