التصوير في الوقت الحقيقي والتحديد الكمي للتنمية بيوفيلم الفطرية باستخدام نظام تدفق دائرية ذات مرحلتين

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة، مثل كيفية تغيير تدفق السوائل نمو وتطور الأغشية الحيوية الفطرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بتقييم كمي لآثار التدفق على نمو وتطور الأفلام الحيوية في الوقت الحقيقي. تبدأ هذه التجربة مع تجميع جهاز تدفق، كما هو موضح في بروتوكول النص.

في يوم التجربة، قم بإرفاق فخ الفقاعة، ومسبار درجة الحرارة، وجميع مكونات الاستخدام الفردية. لتجميع المرشح، قم بإزالة المكبس من حقنة ذات ملليلتر واحدة لجعله محولًا. فرض الأنابيب من زجاجة تصفية في هذه الغاية واربط مرشح 2 ميكرون إلى الأنابيب المؤدية إلى قارورة النمو.

تطبيق الشحوم فراغ سيليكون حول بارب من محول الشريحة قبل توصيله، وهذا يساعد على منع تسرب الهواء في النظام. ملء قارورة المرفق مع 100 ملليلتر من YPD، وملء قارورة النمو مع 200 ملليلتر من YPD. تأكد من أن أنابيب الجانب الأخضر تصل إلى وسائل الإعلام في كل قارورة.

تأكد من أن جميع الصمامات مفتوحة. إرفاق فخ فقاعة إلى فراغ، وربط المضخة إلى الجانب الأخضر أنابيب المصب من فخ فقاعة. ضخ السائل بمعدل تدفق 3.3 ملليلتر في الدقيقة الواحدة لملء تماما الجانب الأخضر.

ثم dispense والتخلص من ما يقرب من 1-2 ملليلتر من وسائل الإعلام، لأن أول زوجين من milliliters غالبا ما تحتوي على خلايا ميتة أو الحطام العشوائي. تأكد من أن الجانب الأخضر من الأنابيب مليء وسائل الإعلام وليس لديه فقاعات المصب من فخ فقاعة قبل المضي قدما. ملء شريحة القناة والخزان مع YPD، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات.

قم بتوصيل الشريحة بجهاز التدفق. ثم ضخ المزيد من السوائل لإنشاء عازلة من حوالي 5 أمتار على الجانب البرتقالي. هذا هو لمنع بطريق الخطأ محاصرة الهواء في الشريحة في حالة تدفق الظهر.

الآن، وإعداد جهاز تدفق للنقل إلى المجهر عن طريق أول زرع مدخل ومنفذ من فخ فقاعة مغلقة. ثم المشبك الأخضر والبرتقالي جانب مرفق صمامات مغلقة. تأكد من أن قبعات المسمار لإخماد النبض وزجاجة مرشح ضيقة، لأنها يمكن أن تخفف أثناء الطلاء التلقائي.

افصل المضخة من الأنابيب لتسهيل النقل. ثم نقل جميع المكونات، بما في ذلك لوحة الساخنة، في حاوية ثانوية بالقرب من المجهر. إرفاق مسبار درجة الحرارة إلى مُحرّك الصفيحة الساخنة، والبدء في تسخين قارورة المرفق إلى 37 درجة مئوية.

حرك وسائل الإعلام في 300 دورة في الدقيقة، والحفاظ على هذا لكامل التجربة. قم بتركيب الشريحة على المجهر، واستخدم الشريط إذا لزم الأمر لتأمينه بإحكام. ثم نعلق فخ فقاعة إلى فراغ.

الآن، قم بتوصيل المضخة بجهاز التدفق. بدء المضخة بمعدل تدفق 3.3 ملليلتر في الدقيقة الواحدة، والسماح لها لتشغيل لمدة خمس إلى 10 ثوان تقريبا. ثم، إزالة فخ فقاعة في السماح التدريجي عشيرة غطاء.

السماح للمضخة لمواصلة تشغيل بينما قارورة المرفقات يسخن. مرة واحدة في قارورة المرفق وغرفة الحضانة على حد سواء في 37 درجة مئوية، إضافة ما يكفي من ثقافة بين عشية وضحاها من الخلايا الفطرية إلى قارورة المرفق للوصول إلى مليون خلية لكل ملليلتر. انتظر 15 دقيقة للسماح للخلايا بالتأقلم.

فتح كل من صمامات قارورة جانبية خضراء وبرتقالية مع إغلاق كل من صمامات قارورة النمو لبدء تدفق الخلايا. انتظر لمدة خمس دقائق تقريباً للسماح للخلايا بالوصول إلى الشريحة. خلال هذا الوقت، ركز المجهر وضبطه مع نفس معلمات التصوير المستخدمة في التجارب السابقة.

ابدأ الحصول على الصورة لمرحلة المرفق. تحقق مرة أخرى بعد حوالي خمس دقائق و 10 لضمان الحفاظ على التركيز. إذا لم يكن كذلك، حاول ضبط التركيز مباشرة بعد الحصول على الصورة التالية.

بعد الانتهاء من مرحلة المرفق مباشرة، قم بحفظ الملف. ثم فتح كل من صمامات قارورة الجانب الأخضر والبرتقالي مع إغلاق كل من صمامات قارورة المرفق. الحرص على عدم عثرة المرحلة إذا كانت هناك أي صمامات داخل غرفة الحضانة.

افصل مسبار ميزان الحرارة، واستبدل قارورة المرفق بقارورة النمو. الآن ، تكوين البرنامج للحصول على صورة كل 15 دقيقة على مدى 22 ساعة ، والبدء في الحصول على صورة لمرحلة النمو. بمجرد الانتهاء من عملية الاستحواذ على مرحلة النمو وحفظ الملف ، افتح صمامات قارورة المرفقات الجانبية الخضراء والبرتقالية ، والتي قد تجعل من الضوضاء إطلاقات الضغط على الجانب البرتقالي.

سحب ما يصل على أنابيب الجانب الأخضر القادمة من كل من قارورة وسائل الإعلام، حتى أنها على الأقل عدة سنتيمترات فوق وسائل الإعلام. ثم، تشغيل المضخة بسرعة عالية لإزالة جميع وسائل الإعلام من الأنابيب، مما يجعل التنظيف أسهل بكثير. وأخيراً، كمي مقاطع الفيديو كما هو موضح في بروتوكول النص.

هذا الوقت الفاصل الظلام حقل المجهر الفيديو يظهر تعلق من نوع البرية المبيضات الخلايا ألبيكية إلى الركيزة تحت التدفق خلال مرحلة المرفق، تليها النمو والتطور اللاحقة خلال مرحلة النمو مما يؤدي إلى تشكيل بيو فيلم. يمكن تحليل البيانات من هذه الفيديوهات عن معدلات مرفق الخلايا وفرزها والكتلة الحيوية مع مرور الوقت، وتظهر هنا الكتلة الحيوية الإجمالية داخل منطقة التصوير كما يحددها تحليل قياس الكثافة. كما يتم عرض المعدل التراكمي لمرفق الخلية وفرز الكتلة الحيوية في المائة مع مرور الوقت.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر استخدام نفس ظروف التصوير في جميع التجارب، لأن هذا يسمح بإجراء مقارنات كمية بينهما.