تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني
نوفمبر 30, 2018
المقدمة هنا هي اثنين من الأساليب التي يمكن استخدامها منفردة أو مجتمعة لتحليل أثر بيتا-اميلويد على هيكل فيبرينوجين جلطة. وشملت بروتوكول لإنشاء في المختبر فيبرينوجين جلطة، تليها التعكر تجلط والمجهر الإلكتروني المسح أساليب.
الميزة الرئيسية لهذه اللوحة القائمة على الكسارة فحص هو أنه سريع ويسمح لعدة مثبطات التفاعل فيبرينوجين اميلويد بيتا ليتم فحصها في وقت واحد دون إعداد متطورة أو متطلبات. يمكن تقييم مركبات الرأس الموجودة في مقايسة التعكر في الـ Fibrin لمزيد من التقييم لقدرتها على استعادة الشذوذ الهيكلي الناجم عن A-beta في جلطات الفيبرين التي تم تحليلها عن طريق مسح المجهر الإلكتروني. إن البرهان المرئي على إعداد الجلطات لمسح التحليل المجهري للإلكترون أمر بالغ الأهمية لأن أي اختلافات في الإعداد يمكن أن تسهم في الاختلافات داخل النتائج التجريبية.
التركيز في هذه المظاهرة هنا هو على التفاعلات الفيبرينوجين A-بيتا. يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتحليل التفاعلات الأخرى مع البروتينات الأخرى والمركبات مع جلطة الفيبرين. تبدأ بإضافة 1.5 micromolar من الفيبرينوجين الطازجة في 200 microliters من تشكيل جلطة العازلة لكل A-بيتا السلبية 42 تحتوي على الآبار والسيطرة واحتضان لوحة على منصة الدورية في درجة حرارة الغرفة.
بعد 30 دقيقة في وقت واحد إضافة 30 ميكرولترات من محلول الخثرات الطازجة المعدة مباشرة إلى مركز الفيرينوجين التي تحتوي على جيدا لبدء تشكيل جلطة وقراءة فورا امتصاص الجلطات في المختبر في 350 نانومتر، وتكرار القياس كل 30 إلى 60 ثانية على مدى 10 دقيقة. لتقييم تأثير مثبطات التفاعل A-beta fibrinogen على هيكل جلطة الفيبرين ، استخدم أولاً ملقط لوضع نظيف ، 12 ملليمترًا غطاء دائرة زجاجية سيليكونية ينزلق إلى الآبار الفردية من لوحة 12 بئرًا وإضافة 80 ميكرولترات من الفيبرينوجين على كل زلة غطاء ، ونشر الحل بلطف بحيث يتم توزيعها بالتساوي. إضافة 20 ميكرولترات من حل ثرومبين إلى كل بئر لبدء تشكيل جلطة.
غطي الطبق لاحتضان لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم غمر كل جلطة بلطف في ميليلترين من عازلة cacodylate الصوديوم الباردة للجليد لمدة دقيقتين ، مغطاة ، في درجة حرارة الغرفة مرتين ، باستخدام ماصة ملليلتر واحدة لإزالة المخزن المؤقت بعناية بعد كل غسل. بعد الغسيل الأخير ، تحقق من حالة تشكيل الجلطة على زلة الغطاء ، ثم قم بإصلاح الجلطات في 2-3 ملليلتر من الثلج البارد 2٪ من الجلوتارالديهيد على الجليد لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة، وإزالة بلطف الجلثارالدهيد من كل بئر وغسل الجلطات مع عازلة الصوديوم الطازجة كما هو موضح على الجليد.
لترطيب الجلطات الثابتة في سلسلة متدرجة من خمس دقائق الإيثانول البارد الجليد يغسل على الجليد دون إزالة الإيثانول تماما بين يغسل للحفاظ على الجلطات محمية من التعرض للهواء. خلال غسل الإيثانول 100٪ الماضي، نقل الغطاء زلات إلى حامل عينة مجفف نقطة حرجة، ووضع ما لا يقل عن 1 غسالة بين كل زلة الغطاء ووضع حامل في غرفة مجفف نقطة حرجة مليئة الإيثانول. بعد دورة تجفيف 30 دقيقة، استخدم شريط الكربون لتركيب الغطاء ينزلق على المجهر الإلكتروني المسح الفردية ونقل العينات إلى غرفة الطلاء sputter من معطف فراغ sputter.
ثم معطف sputter أقل من 20 نانومتر من الذهب البلاديوم أو غيرها من المواد موصل على العينات لمدة 25 ثانية في أربعة angstroms في الثانية الواحدة وصورة العينات على المجهر الإلكتروني المسح مجهزة نوع اثنين كاشف الإلكترونات الثانوية في أربعة كيلوفولت. تكوين جلطة الفيبرين يسبب تشتت الضوء الذي يمر عبر الحل، مما يؤدي إلى زيادة التعكر الذي الهضاب في نهاية فترة القراءة. عندما يتم احتضان الفيبرينوجين في وجود A-بيتا 42 يتناقص عكر الحل مع منحنى تصل إلى أقصى ارتفاع من نصف تقريبا أن من الفيبرينوجين وحده.
في وجود A-بيتا 42 مُنع التفاعل يتم تحسين تأثير بيتا اميلويد والعكر أعلى من ذلك مع بيتا فقط. لا يظهر تأثير مانع بسبب عكر الخلفية كما مركب لا يغير من عكرة تجلط الفيبرين عندما يكون A-beta غائبة. علاوة على ذلك ، فإن تكوين الجلطات في وجود GPRP ، وهو ببتيد معروف بالتدخل في البلمرة الفيبرين ، يوضح انخفاضًا كبيرًا في التعكر مقارنة بتكوين جلطة الفيبرين في غياب المانع.
الفيبرينوجين ولدت في وجود ثربن وكلوريد الكالسيوم تشكل فقط شبكة الفيبرين مع خيوط ممدود ومتشابك من الفيبرين وكذلك حزم أكبر. عندما A-بيتا هو الحاضر, أصبحت أرق المواضيع الفيبرين مع كتل لزجة عدة في المجاميع, مما يدل على تشوهات الهيكلية الناجمة عن A-بيتا. بما يتفق مع نتائج فحص التعكر، تشكيل جلطة في وجود A-بيتا مانع التفاعل الفيبرينوجين جزئيا استعادة هيكل جلطة الفيبرين من التغيرات الناجمة عن A-بيتا كما لوحظ عدد أقل من الكتل مع هذا العلاج.
تم تحسين تحليل تحليل المجهر الإلكتروني الجلطة والمسح الإلكتروني لتقييم العديد من مثبطات التفاعل الفيبرينوجين A-beta بطريقة سريعة وقابلة للتكرار. وقريبا سوف توفر البيانات معلومات قيمة حول تشكيل جلطة الفيبرين التي يمكن تطبيقها على مزيد من الدراسات سواء في المختبر وفي الجسم الحي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طرقاً لتحليل تأثير بيتا-أميلويد على بنية جلطة الفبرين، بما في ذلك بروتوكول لجلطة الفبرين في المختبر وطرق لقياس عكارة الجلطة والمجهر الإلكتروني الماسح.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علوم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- بيولوجيا الخلية
خلفية علمية
- يرتبط بيتا-أميلويد بالأمراض التنكسية العصبية.
- تلعب جلطات الفيبرين دوراً في عمليات بيولوجية متنوعة.
- يمكن أن يوفر فهم بنية جلطة الفيبرين رؤى حول آليات المرض.
- أظهرت الدراسات السابقة وجود تشوهات هيكلية في جلطات الفيبرين نتيجة لـ A-beta.
الغرض من الدراسة
- تقييم تأثير بيتا-أميلويد على بنية جلطة الفبرين.
- فحص مثبطات التفاعلات بين أميلويد-بيتا والفيبرينوجين.
- توضيح كيفية تحضير الجلطات لتحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح.
الطرق المستخدمة
- مقايسة العكر القائمة على الأطباق للفحص السريع.
- تحضير جلطات الفبرين في المختبر باستخدام الفبرينوجين.
- المجهر الإلكتروني الماسح لتحليل بنية الجلطة.
- تعديل البروتوكولات لدراسة تفاعلات بروتينية أخرى.
النتائج الرئيسية
- تحديد المركبات الرئيسية التي تستعيد السلامة الهيكلية.
- يعد التوضيح المرئي لتحضير الجلطة أمراً بالغ الأهمية لضمان الاتساق.
- يمكن أن تؤثر الاختلافات في التحضير على النتائج التجريبية.
- إمكانية تطبيق ذلك على نطاق أوسع في دراسة التفاعلات البروتينية.
الاستنتاجات
- تعد الطرق المعروضة فعالة لتحليل بنية خثرة الفيبرين.
- يمكن أن يؤدي فحص المثبطات إلى اكتساب رؤى حول الاستراتيجيات العلاجية.
- يمكن للأبحاث المستقبلية أن تتوسع في دراسة تفاعلات البروتينات الأخرى.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول إجراء فحص سريع وقابل للتكرار لمثبطات التفاعل بين أميلويد-بيتا والفيبرينوجين باستخدام مقايسة العكر القائمة على الأطباق، مما يدعم التحقق من صحة الأهداف في المراحل المبكرة من تطوير علاجات مرض الزهايمر. توفر هذه الطريقة بيانات كمية حول تكوين الجلطات وتأكيداً هيكلياً عبر المجهر الإلكتروني الماسح، مما يسهل عملية الانتقال من مرحلة اكتشاف المركبات الواعدة إلى تطوير المركبات الرائدة (hit-to-lead) للمركبات التي تخفف من تشوهات جلطات الفيبرين الناجمة عن A-beta. ومن خلال دمج قراءات العكر مع تصوير SEM، يقدم هذا النهج تقليلاً للمخاطر الميكانيكية وثقة تنبؤية لبرامج الاكتشاف التي تستهدف الأوعية الدموية العصبية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يستقصي الفرضية العلاجية التي تشير إلى أن التفاعل بين A-beta والفيبرينوجين يحفز تكوين الجلطات المرضية في مرض ألزهايمر.
- القيمة التشغيلية: يتيح التحقق الوظيفي من الهدف من خلال قياس عكارة الجلطة كمؤشر مباشر لتثبيط ارتباط A-beta بالفيبرينوجين.
- القيمة التنبؤية: يدعم فرز محفظة المركبات من خلال تحديد المركبات التي تعيد بنية جلطة الفيبرين الطبيعية، مما يشير إلى الارتباط بالهدف وتقليل المخاطر البيولوجية.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تتميز مقايسة العكر المُحسَّنة بالسرعة، والقابلية العالية للتكرار، والتوافق مع تنسيقات الأطباق متعددة الآبار لفحص مكتبات المركبات الكبيرة.
- المخرجات الكمية: تقيس الامتصاصية عند 350 nm بمرور الوقت، مما يوفر بيانات حركية لتكون الجلطة تميز كفاءة المثبط عن تأثيرات الخلفية.
- التأكيد البنيوي: يتم التحقق من المركبات الواعدة الناتجة عن فحص العكر باستخدام SEM لتصور استعادة بنية جلطة الفيبرين، مما يضمن أن النتائج ليست مجرد آثار اصطناعية للمقايسة.
الأبحاث translationية والما قبل سريرية
- الصلة بالمرض: ينمذج آلية وعائية دماغية لاعتلالات مرض ألزهايمر، حيث يربط بين A-beta وتشوهات خثرة الفبرين المرتبطة باحتشاءات دقيقة واعتلال الأوعية الدموية الأميلويدي الدماغي.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين ارتباط الهدف في المختبر (العكارة) وبنية الخثرة المظهرية (SEM)، مما يدعم تقليل المخاطر الآلية قبل التحقق من الفعالية داخل الكائن الحي.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يتيح اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف بناءً على معيارين مزدوجين: تثبيط تأخير تكوين الخثرة وعكس التشوهات البنيوية.
تكامل مسارات العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن مرحلة الاكتشاف المبكر، مما يتيح اختبار فرضية التفاعل بين A-beta وfibrinogen كهدف قابل للاستهداف دوائياً، حيث تساهم المخرجات في تدفقات عمل تحديد المركبات الرائدة والتحقق قبل السريري.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال قياس كيفية تغيير A-beta لعكارة وبنية جلطة الفبرين، مما يوضح مشاركة المسار في الخلل الوظيفي الوعائي العصبي.
- المسح: يوفر جاهزية المقايسة وقابلية التكرار للتقييم عالي الإنتاجية لمثبطات التفاعل بين A-beta والفبرينوجين في تنسيق لوحة ذات 96 بئراً.
- التحليلات: يوفر حركية العكارة ومقاييس هيكلية قائمة على SEM تتيح التحليل المقارن لتأثيرات المركبات على تكوين الجلطة وبنيتها.
- الأبحاث الانتقالية: يربط تثبيط الهدف باستعادة النمط الظاهري للجلطة، مما يتماشى مع الاستمرارية قبل السريرية لنماذج الزهايمر الوعائية العصبية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يعد سير عمل العكارة-SEM منصة قابلة لإعادة الاستخدام وتطبق على تفاعلات البروتين-فبرينوجين الأخرى بخلاف A-beta، مما يدعم جهود التحقق من الأهداف على نطاق واسع.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية من خلال ربط التثبيط الكيميائي الحيوي باستعادة البنية الهيكلية للجلطة، مما يقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من الهدف.
- القيمة التشغيلية: تضمن التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال تحسين بروتوكولات تحضير الجلطات، وغسلها، وتثبيتها، وتصويرها.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن جودة قرارات المتابعة أو التوقف (go/no-go) من خلال اشتراط التحقق الوظيفي (العكارة) والتركيب الهيكلي (SEM)، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- التأثير على محفظة المشاريع: تتيح تحديد أولويات المثبطات بناءً على المخاطر المعدلة، والتي تُظهر تصحيحاً مزدوجاً لتأخير تكوين الجلطة والاعتلال الهيكلي.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تحضير البروتينات، ومقايسات تكوين الجلطات، وتحضير عينات المجهر الإلكتروني الماسح.
- يعتمد على توفر قارئ أطباق قادر على إجراء قياسات الامتصاصية الحركية عند 350 nm وجهاز طلاء بالترذيذ الفراغي مع إمكانية التصوير بالمجهر الإلكتروني الماسح SEM.
- يستلزم توحيد خطوات تثبيت الجلطة، وإزالة المياه، والتجفيف لتجنب حدوث تشوهات هيكلية قد تؤدي إلى تفسيرات خاطئة لصور SEM.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند توسيع البروتوكول ليشمل تفاعلات أخرى بين البروتين والفيبرينوجين، خاصة فيما يتعلق بتكوين المنظم (buffer) وأوقات الحضن.
- يشمل قيوداً عملية مثل الحاجة إلى تحضير الكواشف الطازجة والتعامل الدقيق لمنع تباين الجلطات الناتج عن التعرض للهواء أو الغسل غير المتسق.
![تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56279.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A19.245Z&w=384&q=75)
