تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

الميزة الرئيسية لهذه اللوحة القائمة على الكسارة فحص هو أنه سريع ويسمح لعدة مثبطات التفاعل فيبرينوجين اميلويد بيتا ليتم فحصها في وقت واحد دون إعداد متطورة أو متطلبات. يمكن تقييم مركبات الرأس الموجودة في مقايسة التعكر في الـ Fibrin لمزيد من التقييم لقدرتها على استعادة الشذوذ الهيكلي الناجم عن A-beta في جلطات الفيبرين التي تم تحليلها عن طريق مسح المجهر الإلكتروني. إن البرهان المرئي على إعداد الجلطات لمسح التحليل المجهري للإلكترون أمر بالغ الأهمية لأن أي اختلافات في الإعداد يمكن أن تسهم في الاختلافات داخل النتائج التجريبية.

التركيز في هذه المظاهرة هنا هو على التفاعلات الفيبرينوجين A-بيتا. يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتحليل التفاعلات الأخرى مع البروتينات الأخرى والمركبات مع جلطة الفيبرين. تبدأ بإضافة 1.5 micromolar من الفيبرينوجين الطازجة في 200 microliters من تشكيل جلطة العازلة لكل A-بيتا السلبية 42 تحتوي على الآبار والسيطرة واحتضان لوحة على منصة الدورية في درجة حرارة الغرفة.

بعد 30 دقيقة في وقت واحد إضافة 30 ميكرولترات من محلول الخثرات الطازجة المعدة مباشرة إلى مركز الفيرينوجين التي تحتوي على جيدا لبدء تشكيل جلطة وقراءة فورا امتصاص الجلطات في المختبر في 350 نانومتر، وتكرار القياس كل 30 إلى 60 ثانية على مدى 10 دقيقة. لتقييم تأثير مثبطات التفاعل A-beta fibrinogen على هيكل جلطة الفيبرين ، استخدم أولاً ملقط لوضع نظيف ، 12 ملليمترًا غطاء دائرة زجاجية سيليكونية ينزلق إلى الآبار الفردية من لوحة 12 بئرًا وإضافة 80 ميكرولترات من الفيبرينوجين على كل زلة غطاء ، ونشر الحل بلطف بحيث يتم توزيعها بالتساوي. إضافة 20 ميكرولترات من حل ثرومبين إلى كل بئر لبدء تشكيل جلطة.

غطي الطبق لاحتضان لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم غمر كل جلطة بلطف في ميليلترين من عازلة cacodylate الصوديوم الباردة للجليد لمدة دقيقتين ، مغطاة ، في درجة حرارة الغرفة مرتين ، باستخدام ماصة ملليلتر واحدة لإزالة المخزن المؤقت بعناية بعد كل غسل. بعد الغسيل الأخير ، تحقق من حالة تشكيل الجلطة على زلة الغطاء ، ثم قم بإصلاح الجلطات في 2-3 ملليلتر من الثلج البارد 2٪ من الجلوتارالديهيد على الجليد لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة، وإزالة بلطف الجلثارالدهيد من كل بئر وغسل الجلطات مع عازلة الصوديوم الطازجة كما هو موضح على الجليد.

لترطيب الجلطات الثابتة في سلسلة متدرجة من خمس دقائق الإيثانول البارد الجليد يغسل على الجليد دون إزالة الإيثانول تماما بين يغسل للحفاظ على الجلطات محمية من التعرض للهواء. خلال غسل الإيثانول 100٪ الماضي، نقل الغطاء زلات إلى حامل عينة مجفف نقطة حرجة، ووضع ما لا يقل عن 1 غسالة بين كل زلة الغطاء ووضع حامل في غرفة مجفف نقطة حرجة مليئة الإيثانول. بعد دورة تجفيف 30 دقيقة، استخدم شريط الكربون لتركيب الغطاء ينزلق على المجهر الإلكتروني المسح الفردية ونقل العينات إلى غرفة الطلاء sputter من معطف فراغ sputter.

ثم معطف sputter أقل من 20 نانومتر من الذهب البلاديوم أو غيرها من المواد موصل على العينات لمدة 25 ثانية في أربعة angstroms في الثانية الواحدة وصورة العينات على المجهر الإلكتروني المسح مجهزة نوع اثنين كاشف الإلكترونات الثانوية في أربعة كيلوفولت. تكوين جلطة الفيبرين يسبب تشتت الضوء الذي يمر عبر الحل، مما يؤدي إلى زيادة التعكر الذي الهضاب في نهاية فترة القراءة. عندما يتم احتضان الفيبرينوجين في وجود A-بيتا 42 يتناقص عكر الحل مع منحنى تصل إلى أقصى ارتفاع من نصف تقريبا أن من الفيبرينوجين وحده.

في وجود A-بيتا 42 مُنع التفاعل يتم تحسين تأثير بيتا اميلويد والعكر أعلى من ذلك مع بيتا فقط. لا يظهر تأثير مانع بسبب عكر الخلفية كما مركب لا يغير من عكرة تجلط الفيبرين عندما يكون A-beta غائبة. علاوة على ذلك ، فإن تكوين الجلطات في وجود GPRP ، وهو ببتيد معروف بالتدخل في البلمرة الفيبرين ، يوضح انخفاضًا كبيرًا في التعكر مقارنة بتكوين جلطة الفيبرين في غياب المانع.

الفيبرينوجين ولدت في وجود ثربن وكلوريد الكالسيوم تشكل فقط شبكة الفيبرين مع خيوط ممدود ومتشابك من الفيبرين وكذلك حزم أكبر. عندما A-بيتا هو الحاضر, أصبحت أرق المواضيع الفيبرين مع كتل لزجة عدة في المجاميع, مما يدل على تشوهات الهيكلية الناجمة عن A-بيتا. بما يتفق مع نتائج فحص التعكر، تشكيل جلطة في وجود A-بيتا مانع التفاعل الفيبرينوجين جزئيا استعادة هيكل جلطة الفيبرين من التغيرات الناجمة عن A-بيتا كما لوحظ عدد أقل من الكتل مع هذا العلاج.

تم تحسين تحليل تحليل المجهر الإلكتروني الجلطة والمسح الإلكتروني لتقييم العديد من مثبطات التفاعل الفيبرينوجين A-beta بطريقة سريعة وقابلة للتكرار. وقريبا سوف توفر البيانات معلومات قيمة حول تشكيل جلطة الفيبرين التي يمكن تطبيقها على مزيد من الدراسات سواء في المختبر وفي الجسم الحي.