نموذج في المختبر نظام التروية التوازي-لوحة لدراسة البكتيريا التمسك Graft الأنسجة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في التسبب في التهاب الشغاف المعدي ، و pathobiograms من خلال حقول مثل التفاعل بين البكتيريا وخلايا الدم والخلايا البطانية بطانة العضلات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الطعوم الأنسجة قد تتعرض مباشرة للتفاعلات المتبادلة مع أهداف مختلفة, مثل البكتيريا, الصفائح الدموية, والبروتينات في ظروف تدفق موحدة. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد إلى العلاج لدينا من التهاب الشغاف المعدية، لأنه يمكن كشف التفاعلات الجزيئية الهامة والعوامل التي تدفع العدوى عالية من بعض الأنسجة.

توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للأمراض من تشكيل الغطاء النباتي. ويمكن أيضا أن تكون قابلة للتطبيق في الدراسات التي تحقق نفاذية الأوعية الدموية, الخلية التنقل, والتعبير الخلية الجينية. للبدء في البروتوكول ، ضع خزعة نسيج معدة مسبقًا قطرها 10 ملليمترات ، ونفس السمك بين شريحة المجهر وانثقاب دائري ثمانية ملليمترات ، و طوقا مطاطيًا مع السطح الداخلي المواجه لأعلى ، للاتصال بالتعليق البكتيري.

التركيز على التوجه الكسب غير المشروع الأنسجة في حين وضعت في حامل. تأكد من أن السطح الداخلي للأنسجة يتعرض بالفعل لوجوه مجرى الدم حتى الاتصال بوسيلة التجريبية الخاصة بك. بعد ذلك، أدخل حاملك مع الأنسجة في ورقة طوقا التي هي جزءا لا يتجزأ من الإطار المعدني السفلي من الغرفة.

إرفاق الإطار المعدني العلوي مع ورقة طوقا المقابلة على الجزء السفلي من الغرفة مع حامل الأنسجة المدرجة سابقا. ثم جبل الغرفة بأكملها مع ثمانية مسامير والمكسرات المسمار. تأكد من أن ارتفاع الغرفة هو نفسه دائما عبر الطعوم باستخدام الفرجر أو المسطرة.

المقبل ربط غرفة تدفق مع مضخة ال peristaltic. ثم قم بتوصيل خزان السائل 400 ملليلتر مع الأنابيب. اثقب الأنسجة بموا تعليق 100 ملليلتر من عشرة إلى سبعة وحدات مستعمرة تحمل علامة الفلورسنت في محلول ملحي مؤقت للفوسفات مع الإجهاد الهائل لثلاثة تناول الطعام لكل سنتيمتر مربع ومعدل تدفق مقابل قدره أربعة ملليلتر في الدقيقة لمدة ساعة واحدة باستخدام المضخة الاطئجة والخزان البكتيري.

إعادة تدوير باستمرار تعليق البكتيريا 100 ملليلتر باستخدام خزان جمع نفسه. بعد التسريب، تفكيك الغرفة للافراج عن الكسب غير المشروع. غسل قطعة الأنسجة مرتين مع أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني في لوحة 12-جيدا باستخدام شاكر المدارية لمدة ثلاث دقائق.

ثم قطع الجزء الداخلي من الكسب غير المشروع باستخدام لكمة خزعة الجلد مع قطر أصغر. ضع كل خزعة نسيجية في أنبوب منفصل 14 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9٪. فصل البكتيريا من الأنسجة باستخدام حمام سونيكيشن لمدة 10 دقائق.

إعداد أنبوب واحد 14 ملليلتر مع 10 ملليلتر من كلوريد الصوديوم 0.9٪ العقيمة لجعل التخفيفات التسلسلية من التعليق البكتيرية التي تم الحصول عليها بعد سونيكيشن. تسمية الأنبوب رقم اثنين. إعداد ثلاثة 14 ملليلتر أنابيب مع 10 ملليلتر من كلوريد الصوديوم معقمة 0.9٪ لتخفيف المسلسل من التعليق البكتيري الأولي التي اتخذت لتجربة الوفرة.

تسمية الأنابيب رقم ثلاثة، رقم أربعة، ورقم خمسة. المقبل، وتأمين ثلاثة لوحات أجار، واحدة للضخ البكتيري، واحدة للضخ السيطرة من برنامج تلفزيوني، والثالث للتعليق البكتيرية الأولية المستخدمة في الضخ. تسمية ثلاثة قطاعات لكل لوحة لتجربة الأنسجة على النحو التالي: 10-1، 10-3، و 10-4.

لحساب عدد وحدات تشكيل مستعمرة في البكتريا، وتسمية لوحة على النحو التالي: 10-1، 10-3، 10-5، و 10-7. دوامة الأنابيب التي تحتوي على خزعة الأنسجة لمدة 15 ثانية لكل من، لجعل التخفيفات المسلسل. لإعداد التخفيفات التسلسلية، نقل 100 ميكرولترات من أنبوب رقم واحد إلى أنبوب رقم اثنين، ودوامة الأنبوب لخلط شامل الحل.

انتشار 100 ميكرولترات من محتويات أنبوب رقم واحد ورقم اثنين على القطاعات المقابلة، 10-1 و 10-3 من لوحة أجار. ثم انتشرت 10 ميكروليتر من أنبوب رقم اثنين على القطاع 10 أربعة. كرر هذه الخطوة أربع مرات للحصول على أربعة نمو منفصلة من كل وحدة تخزين من 10 ميكرولترات.

لإعداد التخفيفات التسلسلية للثقافة الأولية ، أول دوامة التخفيف لمدة 15 ثانية ونقل 100 ميكرولترات من التعليق البكتيري إلى أنبوب رقم ثلاثة ، ويخلط بقوة عن طريق الدوامة. إضافة 100 ميكروليتر من أنبوب رقم ثلاثة إلى أنبوب رقم أربعة واخلط مرة أخرى. كرر الإجراء للأنبوب رقم خمسة من الأنبوب رقم أربعة.

انتشار 100 ميكرولترات من محتويات أنابيب رقم ثلاثة، رقم أربعة، رقم خمسة، والثقافة الأولية المسمى على التوالي على القطاعات 10-3، 10-5، 10-7، و 10-1 من صفيحة أجار الدم. اتركي ألواح أجار الدم تحت غطاء غطاء الرأس الهوائي لتجفيف البكتيريا، عادةً لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، ضع اللوحات عند 37 درجة مئوية للحضانة بين عشية وضحاها.

بعد حضانة بين عشية وضحاها، عد المستعمرات البكتيرية للحصول على عدد من CFUs. في ظل ظروف الإجهاد المطلق ، لوحظ مرفق بكتيري مماثل عبر أنسجة الكسب غير المشروع المختلفة لكل من عدوى المكورات العنقودية وعدوى المكورات العنقودية. بعد الإجراءات ، أظهر المكورات العقدية sanguinis انخفاضًا كبيرًا في الالتزام بجدار الوريد الوداجي البقري ، بالمقارنة مع رقعة pericardium البقرية.

عند مقارنة الأنواع الثلاثة من البكتيريا، يقدم المكورات العقدية sanguinis أقل بكثير التصاق إلى جدار الوريد الوريدي البقري فيما يتعلق المكورات العنقودية aureus وsedermidis المكورات العنقودية. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن تكون قد أعدت الأنسجة الصحيحة من نفس الرأس. وسوف يضمن ظروفا مماثلة عبر جميع عينات التجربة ويقلل من تقلب البيانات بين سلسلة مختلفة من التجارب.

بعد تطورها، تسمح هذه التقنية للباحثين باستكشاف أنظمة الاضطراب المعقدة بطريقة تدريجية من خلال إثراء مقارباتهم النموذجية في المختبر بعناصر مختلفة لبناء تعقيد كامل قريب من الحالة الطبية.