تحليل التعبير الجيني غشائي الخلايا المعرضة للإجهاد باستخدام عدة تدفق مواز-لوحة الدوائر للقص

هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء البطانية، مثل لماذا الأوعية الدموية لديها اختلافات إقليمية في تطوير تصلب الشرايين؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح للدراسة في وقت واحد من حالات متعددة في ظل الإجهاد القص أو حالات إجهاد القص متعددة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو فهم تنظيم الجينات البطانية في كل من الأنظمة الشريانية والوريدية لأنه يمكن استخدام معدلات التدفق والأنماط المختلفة.

حسناً هنا، نُظهر نظاماً يستخدم تدفقاً ثابتاً للرقان. يمكن تكييف الإعداد مع أنماط التدفق الأخرى، بما في ذلك التدفق المضطرب. عموما، سوف الأفراد الجدد لهذا الأسلوب النضال من أجل الحفاظ على أحادية مستمرة من الخلايا طوال مدة التجربة والحصول على نتائج متسقة بين التجارب.

24 ساعات قبل التحليل، عد الخلايا البطانية البشرية في مرور مبكر والبذور ما يقرب من مرة واحدة مرة واحدة إلى الخلايا السادسة في ملليلتر واحد من المتوسطة على شريحة زجاجية مغلفة ليفية واحدة في بئر من لوحة ثقافة خلية أربعة بئر. السماح للخلايا إلى التمسك الشريحة لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية. ثم تغطية كل شريحة مع ثلاثة ملليلتر من المتوسط ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية من 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

في يوم التجربة، املأ صينية المياه في بيئة كبيرة ومُسخنة ومدمجة مع ثاني أكسيد الكربون القابل للتعديل والحرارة، أو حاضنة الشاطئ، مع رفوف متعددة، وإمكانية وصول داخلية للكهرباء، وأبواب زجاجية، وتأكد من أن ثاني أكسيد الكربون متاح للتجربة، وأن شاشة ثاني أكسيد الكربون تعمل. لإعداد غرفة التدفق ، أدخل إغراء أنثى 1/8 بوصة في نهاية واحدة من أنبوب ناعم رقم 16 ، واربط stopcock رباعية الاتجاه إلى الإغراء. نعلق على نهاية حرة من الأنبوب إلى الجانب تدفق من لوحة العلوي وإدراج 1/8th بوصة إغراء الذكور في نهاية واحدة من الثانية عدد 16 أنبوب لينة.

نعلق stopcock رباعية الاتجاه إلى إغراء الذكور، وإرفاق نهاية حرة من الأنبوب إلى الجانب الخارج من لوحة العلوي. إدراج 1/8th بوصة إغراء الذكور و1/8th بوصة إغراء الإناث في كل نهاية من أنبوب 16 رقم ثالث لينة، وأرفق الأنابيب إلى فخ فقاعة عبر إغراء الذكور بوصة 1/8th. ثم نعلق stopcock رباعية الاتجاه إلى الطرف الآخر من الأنابيب عن طريق إغراء الإناث.

باستخدام ملاقط معقمة، نقل شريحة زجاجية بذر خلية واحدة إلى العطلة على لوحة أسفل، خلية بذر الجانب. استخدام حقنة 10 ملليلتر لإضافة 10 ملليلتر من المتوسطة الدافئة إلى لوحة أسفل داخل خط طوقا الأحمر حول لوحة. السماح للوسيلة بالتدفق عبر الشريحة وتغطية الخلايا.

ضع اللوحة العلوية بلطف على اللوحة السفلية مع الحرص على محاذاة الجانبين وبرغي اللوحات معًا بإحكام. لإزالة فقاعات الهواء من فخ فقاعة، أولا فتح تدفق و فخ فقاعة stopcocks وإغلاق stopcock تدفق. ثم استخدام حقنة 30 ملليلتر لطرد بلطف 20 ملليلتر من المتوسطة الدافئة من خلال لوحة.

لإزالة الفقاعات من الغرفة، أغلق فخ فقاعة stopcock وفتح stopcock الخارج. رفع الجانب الخارج من الغرفة إلى زاوية 45 درجة واستخدام حقنة 30 ملليلتر لمسح بلطف 20 ملليلتر من المتوسطة الدافئة من الجانب تدفق الغرفة. من المهم أن تتدفق بمعدل مناسب في اتجاه تدفق واستخدام المجهر للتأكد من أن أحادية أحادية التقاء من الخلايا يبقى قبل تعريض الخلايا لتدفق لارينار.

ثم أغلق الـ stopcocks على جانبي الغرفة والغطاء وتأكد من أن الخلايا لا تزال ملتصقة بالشريحة تحت مجهر خفيف. مكان غرفة تدفق ونظام حلقة تدفق تجميعها سابقا في الشاطئ، وانخفاض سرعة مضخة ببطء من الجمعية حلقة تدفق قبل التوقف مضخة تماما. إغلاق stopcocks على نظام حلقة تدفق لمنع التسرب وتوصيل نظام الدائرة وحلقة معا عن طريق stopcocks.

عندما تم توصيل جميع الحلقات، إعادة فتح جميع الـ stopcocks وزيادة سرعة المضخة ببطء أثناء مراقبة الإعداد لأي تسرب أو انسداد. وضع جهاز استشعار تدفق على أنابيب جسر الغرفة من الجانب تدفق الغرفة مع جهاز استشعار الموجهة في اتجاه تدفق وضبط سرعة المضخة للحصول على معدل تدفق لحصة القص معدل الإجهاد من الفائدة. ثم تشغيل خزان CO2 لتحقيق تركيز C02 5٪.

بمجرد اكتمال فترة التدفق التجريبي ، قم بتقليل سرعة المضخة ال peristaltic ببطء إلى الصفر وإيقاف تشغيل الطاقة. إغلاق بسرعة كل من stopcocks مفتوحة ونقل الغرفة وأنابيب المرفقة مع stopcock على كل جانب إلى أعلى مقاعد البدلاء نظيفة. فك بعناية جميع مسامير لإزالة لوحة العلوي واستخدام إبرة الانف ملاقط لنقل الشريحة الزجاجية من لوحة أسفل إلى 100 ملليمتر قطر طبق.

اغسل الشريحة بـ 10 ملليلترات من PBS البارد وتحقق من الخلايا تحت المجهر لتأكيد التزام الخلية والمحاذاة في اتجاه التدفق. بعد التعرق في برنامج تلفزيوني، ونقل الشريحة إلى طبق قطرها 100 ملليمتر نظيفة وإضافة 350 ميكرولتردات من العازلة تحلل تكمل مع 1/100th من بيتا ميركباتوينول من طقم استخراج RNA إلى الشريحة. استخدام مكشطة خلية البولي إيثيلين شفرة لكشط الخلايا قبالة الشريحة وإمالة طبق ثقافة الأنسجة للسماح للمخزن المؤقت للتجمع في الجزء السفلي.

استخدام ملقط لإزالة الشريحة والماصات الخلية lysate في أنبوب 1.5 ملليلتر على الجليد. ثم إضافة 10 ميكروليترس من الحمض النووي الريبي luciferase المخفف إلى الخلية lysate لعزل الحمض النووي الريبي المصب والتحليل وفقا للبروتوكولات القياسية. ويمكن تأكيد الخطية الناجحة من بلاسميد luciferase باستخدام إنزيمات تقييد عن طريق تشغيل المنتجات المهضومة على هلام agarose وحجم المنتج الخطي يمكن تأكيد مع سلالم الحمض النووي وبالمقارنة مع plasmid غير المصقول.

يمكن أن تؤدي عمليات التصنيع إلى اختلافات صغيرة في ارتفاع الغرفة ، وبالتالي يجب حساب معدل التدفق لكل غرفة لتحقيق نفس الإجهاد القص. للتجارب التي تتضمن إجهاد القص اللاميني في الخلايا البطانية الثديية، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي اليراعات كـ RNA خارجي الارتفاع في. تطبيع الجينات المرجعية الذاتية، والجينة المرجعية الخارجية، والجينات المرجعية الداخلية والخارجية معا تسفر عن نتائج مماثلة.

من الجدير بالذكر، في هذه التجارب التمثيلية باستخدام غرفتين تدفق تشغيل في وقت واحد مع الإجهاد القص في باسكال واحد لكل تجربة، كروبل مثل عامل اثنين الضربة القاضية عبر SI-RNA أسفرت عن كفاءة ضربة قاضية مماثلة بين العينات البيولوجية اختبارها. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر لتأسيس أحادية حتى من الخلايا على الشريحة وإسراف نظام حلقة تدفق قبل إرفاق غرفة تدفق. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي، لتقييم التعبير الحمض النووي الريبي الواسع للجينة وغيرها من قراءات، مثل الحمض النووي والبروتين، يمكن استخدامها لمزيد من التحليل الجزيئي.

بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا البطانية لاستكشاف العلاقة بين إجهاد القص وإمكانات الأوعية في الخلايا البطانية البشرية.