تحليل التعبير الجيني غشائي الخلايا المعرضة للإجهاد باستخدام عدة تدفق مواز-لوحة الدوائر للقص
October 21st, 2018
ويرد هنا، سير عمل لتحليل التعبير الثقافة والجينات لخلايا بطانية إجهاد القص السوائل. وشملت ترتيب مادية للسكن ورصد الدوائر التدفق متعددة في بيئة تسيطر عليها، واستخدام الحمض النووي الريبي مرجعية خارجية ل PCR الكمي في الوقت نفسه.
هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء البطانية، مثل لماذا الأوعية الدموية لديها اختلافات إقليمية في تطوير تصلب الشرايين؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح للدراسة في وقت واحد من حالات متعددة في ظل الإجهاد القص أو حالات إجهاد القص متعددة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو فهم تنظيم الجينات البطانية في كل من الأنظمة الشريانية والوريدية لأنه يمكن استخدام معدلات التدفق والأنماط المختلفة.
حسناً هنا، نُظهر نظاماً يستخدم تدفقاً ثابتاً للرقان. يمكن تكييف الإعداد مع أنماط التدفق الأخرى، بما في ذلك التدفق المضطرب. عموما، سوف الأفراد الجدد لهذا الأسلوب النضال من أجل الحفاظ على أحادية مستمرة من الخلايا طوال مدة التجربة والحصول على نتائج متسقة بين التجارب.
24 ساعات قبل التحليل، عد الخلايا البطانية البشرية في مرور مبكر والبذور ما يقرب من مرة واحدة مرة واحدة إلى الخلايا السادسة في ملليلتر واحد من المتوسطة على شريحة زجاجية مغلفة ليفية واحدة في بئر من لوحة ثقافة خلية أربعة بئر. السماح للخلايا إلى التمسك الشريحة لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية. ثم تغطية كل شريحة مع ثلاثة ملليلتر من المتوسط ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية من 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
في يوم التجربة، املأ صينية المياه في بيئة كبيرة ومُسخنة ومدمجة مع ثاني أكسيد الكربون القابل للتعديل والحرارة، أو حاضنة الشاطئ، مع رفوف متعددة، وإمكانية وصول داخلية للكهرباء، وأبواب زجاجية، وتأكد من أن ثاني أكسيد الكربون متاح للتجربة، وأن شاشة ثاني أكسيد الكربون تعمل. لإعداد غرفة التدفق ، أدخل إغراء أنثى 1/8 بوصة في نهاية واحدة من أنبوب ناعم رقم 16 ، واربط stopcock رباعية الاتجاه إلى الإغراء. نعلق على نهاية حرة من الأنبوب إلى الجانب تدفق من لوحة العلوي وإدراج 1/8th بوصة إغراء الذكور في نهاية واحدة من الثانية عدد 16 أنبوب لينة.
نعلق stopcock رباعية الاتجاه إلى إغراء الذكور، وإرفاق نهاية حرة من الأنبوب إلى الجانب الخارج من لوحة العلوي. إدراج 1/8th بوصة إغراء الذكور و1/8th بوصة إغراء الإناث في كل نهاية من أنبوب 16 رقم ثالث لينة، وأرفق الأنابيب إلى فخ فقاعة عبر إغراء الذكور بوصة 1/8th. ثم نعلق stopcock رباعية الاتجاه إلى الطرف الآخر من الأنابيب عن طريق إغراء الإناث.
باستخدام ملاقط معقمة، نقل شريحة زجاجية بذر خلية واحدة إلى العطلة على لوحة أسفل، خلية بذر الجانب. استخدام حقنة 10 ملليلتر لإضافة 10 ملليلتر من المتوسطة الدافئة إلى لوحة أسفل داخل خط طوقا الأحمر حول لوحة. السماح للوسيلة بالتدفق عبر الشريحة وتغطية الخلايا.
ضع اللوحة العلوية بلطف على اللوحة السفلية مع الحرص على محاذاة الجانبين وبرغي اللوحات معًا بإحكام. لإزالة فقاعات الهواء من فخ فقاعة، أولا فتح تدفق و فخ فقاعة stopcocks وإغلاق stopcock تدفق. ثم استخدام حقنة 30 ملليلتر لطرد بلطف 20 ملليلتر من المتوسطة الدافئة من خلال لوحة.
لإزالة الفقاعات من الغرفة، أغلق فخ فقاعة stopcock وفتح stopcock الخارج. رفع الجانب الخارج من الغرفة إلى زاوية 45 درجة واستخدام حقنة 30 ملليلتر لمسح بلطف 20 ملليلتر من المتوسطة الدافئة من الجانب تدفق الغرفة. من المهم أن تتدفق بمعدل مناسب في اتجاه تدفق واستخدام المجهر للتأكد من أن أحادية أحادية التقاء من الخلايا يبقى قبل تعريض الخلايا لتدفق لارينار.
ثم أغلق الـ stopcocks على جانبي الغرفة والغطاء وتأكد من أن الخلايا لا تزال ملتصقة بالشريحة تحت مجهر خفيف. مكان غرفة تدفق ونظام حلقة تدفق تجميعها سابقا في الشاطئ، وانخفاض سرعة مضخة ببطء من الجمعية حلقة تدفق قبل التوقف مضخة تماما. إغلاق stopcocks على نظام حلقة تدفق لمنع التسرب وتوصيل نظام الدائرة وحلقة معا عن طريق stopcocks.
عندما تم توصيل جميع الحلقات، إعادة فتح جميع الـ stopcocks وزيادة سرعة المضخة ببطء أثناء مراقبة الإعداد لأي تسرب أو انسداد. وضع جهاز استشعار تدفق على أنابيب جسر الغرفة من الجانب تدفق الغرفة مع جهاز استشعار الموجهة في اتجاه تدفق وضبط سرعة المضخة للحصول على معدل تدفق لحصة القص معدل الإجهاد من الفائدة. ثم تشغيل خزان CO2 لتحقيق تركيز C02 5٪.
بمجرد اكتمال فترة التدفق التجريبي ، قم بتقليل سرعة المضخة ال peristaltic ببطء إلى الصفر وإيقاف تشغيل الطاقة. إغلاق بسرعة كل من stopcocks مفتوحة ونقل الغرفة وأنابيب المرفقة مع stopcock على كل جانب إلى أعلى مقاعد البدلاء نظيفة. فك بعناية جميع مسامير لإزالة لوحة العلوي واستخدام إبرة الانف ملاقط لنقل الشريحة الزجاجية من لوحة أسفل إلى 100 ملليمتر قطر طبق.
اغسل الشريحة بـ 10 ملليلترات من PBS البارد وتحقق من الخلايا تحت المجهر لتأكيد التزام الخلية والمحاذاة في اتجاه التدفق. بعد التعرق في برنامج تلفزيوني، ونقل الشريحة إلى طبق قطرها 100 ملليمتر نظيفة وإضافة 350 ميكرولتردات من العازلة تحلل تكمل مع 1/100th من بيتا ميركباتوينول من طقم استخراج RNA إلى الشريحة. استخدام مكشطة خلية البولي إيثيلين شفرة لكشط الخلايا قبالة الشريحة وإمالة طبق ثقافة الأنسجة للسماح للمخزن المؤقت للتجمع في الجزء السفلي.
استخدام ملقط لإزالة الشريحة والماصات الخلية lysate في أنبوب 1.5 ملليلتر على الجليد. ثم إضافة 10 ميكروليترس من الحمض النووي الريبي luciferase المخفف إلى الخلية lysate لعزل الحمض النووي الريبي المصب والتحليل وفقا للبروتوكولات القياسية. ويمكن تأكيد الخطية الناجحة من بلاسميد luciferase باستخدام إنزيمات تقييد عن طريق تشغيل المنتجات المهضومة على هلام agarose وحجم المنتج الخطي يمكن تأكيد مع سلالم الحمض النووي وبالمقارنة مع plasmid غير المصقول.
يمكن أن تؤدي عمليات التصنيع إلى اختلافات صغيرة في ارتفاع الغرفة ، وبالتالي يجب حساب معدل التدفق لكل غرفة لتحقيق نفس الإجهاد القص. للتجارب التي تتضمن إجهاد القص اللاميني في الخلايا البطانية الثديية، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي اليراعات كـ RNA خارجي الارتفاع في. تطبيع الجينات المرجعية الذاتية، والجينة المرجعية الخارجية، والجينات المرجعية الداخلية والخارجية معا تسفر عن نتائج مماثلة.
من الجدير بالذكر، في هذه التجارب التمثيلية باستخدام غرفتين تدفق تشغيل في وقت واحد مع الإجهاد القص في باسكال واحد لكل تجربة، كروبل مثل عامل اثنين الضربة القاضية عبر SI-RNA أسفرت عن كفاءة ضربة قاضية مماثلة بين العينات البيولوجية اختبارها. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر لتأسيس أحادية حتى من الخلايا على الشريحة وإسراف نظام حلقة تدفق قبل إرفاق غرفة تدفق. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي، لتقييم التعبير الحمض النووي الريبي الواسع للجينة وغيرها من قراءات، مثل الحمض النووي والبروتين، يمكن استخدامها لمزيد من التحليل الجزيئي.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا البطانية لاستكشاف العلاقة بين إجهاد القص وإمكانات الأوعية في الخلايا البطانية البشرية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة سير عمل لتحليل ثقافة وتعبير الجينات للخلايا البطانية تحت إجهاد القص السائل. يتضمن ترتيبًا ماديًا لمراقبة غرف التدفق المتعددة واستخدام إشارة RNA خارجية لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا البطانة
- تحليل تعبير الجينات
- تأثيرات إجهاد القص السائل
الخلفية
- فهم الاختلافات الإقليمية في تطور تصلب الشرايين.
- أهمية دراسة تنظيم الجينات البطانية.
- تطبيق معدلات وأنماط تدفق مختلفة.
- التحديات في الحفاظ على طبقة واحدة مستمرة من الخلايا.
هدف الدراسة
- لتحليل استجابات الخلايا البطانية لإجهاد القص.
- لدراسة تعبير الجينات تحت ظروف تدفق مختلفة.
- لتوفير طريقة موثوقة لدراسة بيولوجيا البطانة.
الطرق المستخدمة
- زراعة الخلايا البطانية تحت إجهاد قص متحكم فيه.
- دراسة متزامنة لعدة ظروف.
- استخدام تدفق طبقي ثابت في التجارب.
- تكيف الإعداد لأنماط تدفق مختلفة.
النتائج الرئيسية
- تبيان نظام لدراسة الخلايا البطانية.
- رؤى حول تنظيم الجينات في الأنظمة الشريانية والوريدية.
- تأسيس طريقة لتحقيق نتائج تجريبية متسقة.
- تحديد التحديات التي يواجهها المستخدمون الجدد لهذه الطريقة.
الاستنتاجات
- تعزز الطريقة من فهم بيولوجيا البطانة.
- توفر إطارًا لأبحاث المستقبل حول تأثيرات إجهاد القص.
- إمكانية توجيه الاستراتيجيات العلاجية لأمراض الأوعية الدموية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Standardized gene expression analysis of endothelial cells under controlled shear stress conditions addresses a critical need for predictive vascular biology models in early discovery. The use of parallel-plate flow chambers with real-time flow monitoring and exogenous RNA normalization enhances reproducibility and quantitative confidence for target validation. This workflow supports robust mechanistic de-risking and informs portfolio decisions in vascular and cardiovascular research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of endothelial gene regulation under physiologically relevant shear stress.
- Supports mechanistic de-risking by modeling arterial and venous flow conditions.
- Facilitates functional target validation through quantitative gene expression outputs.
- Improves predictive confidence for vascular target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated endothelial systems for downstream compound screening.
- Standardizes assay conditions using real-time flow monitoring and exogenous RNA controls.
- Enables reproducible, quantitative PCR-based readouts across multiple conditions.
- Supports scalable, parallelized workflows for multi-condition analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro shear stress models with in vivo vascular environments for translational relevance.
- Provides continuity from discovery-stage gene expression to preclinical biomarker exploration.
- Reduces biological risk by modeling disease-relevant hemodynamic forces.
- Enables risk-adjusted advancement of vascular targets based on robust mechanistic data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven gene expression studies under controlled shear stress, supporting both target validation and translational biomarker strategies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on endothelial mechanotransduction and gene regulation.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible endothelial models for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative PCR outputs normalized with exogenous RNA for cross-condition comparability.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo vascular biology through physiologically relevant flow modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable platform adaptable to diverse vascular research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of gene expression workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular and cardiovascular research assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in endothelial cell culture and flow chamber operation.
- Needs real-time flow monitoring instrumentation and quantitative PCR infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for multi-condition experiments.
- Adaptable to various flow patterns and model systems with protocol modifications.
- Dependent on precise normalization strategies to minimize sample variability.
