إعداد شرائح الحبل الشوكي الحاد لتسجيل كامل الخلية التصحيح-المشبك في الخلايا العصبية جيلاتينوسا الدماغ

هذه الطريقة يمكن أن تساعد في توضيح آليات العمود الفقري الكامنة تحت انتقال الحسية, nociceptive التنظيم والألم المزمن أو وجع التنمية والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يمكن أن تسمح الحفاظ على الخلايا العصبية المثالية وأنه يمكن تقليد الظروف في vivo إلى حد ما. تبدأ عن طريق سحب أقطاب تسجيل من الزجاج البورسليكات microcapillaries باستخدام سحب الشعيرات الدموية. ثم املأ قالبًا بـ agar المنصهر لإعداد كتلة أجار 1.2 سنتيمترًا في 1.5 سنتيمترًا في 2.0 سنتيمتر.

تقليم كتلة أن يكون لها قناة مركزية إذا التخطيط المقاطع العرضية. أو اللحم قناة مع حافة كتلة لأقسام parasagittal. قبل الإسراف عبر القلب واستخراج الحبل الشوكي، وإعداد 500 ملليلتر من السكروز مقرها ACSF.

تبريد حل للجليد الباردة وتككيل مع 95٪ O2 و 5٪ CO2. تبريد جميع أدوات التشريح على الجليد. جعل شق طولي خمسة سنتيمترات على الجلد الخلفي من السد إلى الرسترالي.

ثم، قطع من خلال القفص الصدري بين العمود الفقري والأضلاع على جانبي. استخدام مقص لجعل قطع في نهاية السد من العمود الفقري. ثم قطع بعيدا الأنسجة المحيطة بها وعزل بسرعة الجزء من العمود الفقري lumbosacral.

نقل الجزء lumbosacral إلى طبق زجاجي يحتوي على الجليد الباردة السكروز مقرها ACSF. مع الجانب البطني التصاعدي، واستخدام مقص غرامة لقطع من خلال pedicle الفقرية ثنائيا وفضح الحبل الشوكي بعناية. عزل مقطع سنتيمترين من الحبل الشوكي مع توسيع اللومترية ونقل القسم الشوكي إلى طبق زجاجي آخر مليء بالسروز البارد ACSF.

العمل تحت مجهر تشريح لإزالة السحائيات والغشاء arachnoid بيا. قطع جميع جذور البطن والثمال بعيدا في أسرع وقت ممكن. الحرص على تجنب إصابة الحبل الشوكي، وخاصة القرن الظهري عند إزالة السحايا والجذور الشوكية.

ضع الحبل الشوكي على كتلة أجار التي تم تشذيبها سابقًا. لإعداد الشرائح العرضية، قم بتوصيل الجانب البطني من الحبل الشوكي بـ agar مع الجانب الظهري نحو النصل. لإعداد شرائح باراسجيتال، قم بتوصيل الجانب البطني مع الغليدو الفائق إلى أجار في اتجاه عمودي.

ثم، جبل كتلة أجار إلى منصة من اهتزاز مع superglue. وإعداد 300 إلى 500 ميكرون شرائح عرضية أو باراسجيتال مع سرعة متقدمة من 0.025 ملليمتر في الثانية الواحدة وتواتر اهتزاز 80 هيرتز. يجب أن يُقطّع الحبل الشوكي إلى شرائح dorso-ventrally.

للحصول على أفضل النتائج، يجب إعداد الشريحة في غضون 15 إلى 20 دقيقة. يجب أن لا يزيد سمك الشريحة الشوكية عن 600 ميكرون لتلبية رؤية الخلية. استخدام ماصة بلاستيكية قلص لنقل شرائح على شبكة النايلون في غرفة تخزين تحتوي على أكسجين باستمرار ACSF في 32 درجة مئوية.

لإجراء تسجيلات المشبك التصحيح الخلية الكاملة من substantia الجيلاتينوزا أو الخلايا العصبية SG، استخدم أيونات البوتاسيوم القائمة على حلول داخل الخلايا للتسجيل أثناء تطبيق محلول الكاتيوم الموجبة القائم فقط لتسجيل التيارات المثبطة بعد متشابك. قم بتحريك شريحة الحبل الشوكي بلطف إلى غرفة التسجيل. ثم استقراره بقوة مع سلك البلاتين على شكل يو مع خيوط النايلون للاستقرار شريحة الأمثل.

بغزارة باطراد شريحة مع ACSF فقاعة في درجة حرارة الغرفة وتعيين معدل الزغرة في 2-4 ملليلتر في الدقيقة الواحدة لتحقيق الأوكسجين كافية. ثم، باستخدام عدسة المجهر منخفضة الدقة، وتحديد منطقة الخلايا العصبية SG كفرقة شفافة. اختيار الخلايا العصبية صحية، تتميز شكل ثلاثي الأبعاد مع غشاء مشرق وسلس كخلية الهدف باستخدام الهدف عالية الدقة وتعديله إلى مركز شاشة الفيديو.

ملء ماصة صغيرة مع حجم مناسب من أيونات البوتاسيوم القائمة أو أيونات القائمة على محلول داخل الخلايا. ثم أدخل الماصات الصغيرة في حامل القطب الكهربائي وتأكد من أن الحل داخل الخلايا يتصل بالأسلاك الفضية داخل الحامل. جلب ماصة صغيرة في التركيز واستخدام micromanipulator لتزج بها في ACSF.

تطبيق ضغط إيجابي معتدل لإجبار أي الأوساخ والحطام. تحرك تدريجيا ماصة صغيرة نحو الخلايا العصبية المستهدفة. مرة واحدة في ماصة تقترب من الخلايا العصبية وأشكال غماز صغيرة جدا على غشاء الخلايا العصبية، والافراج عن الضغط الإيجابي لتشكيل gigaseal.

تغيير احتمال عقد إلى ناقص 70 millivolts، وهو قريب من احتمال غشاء يستريح الفسيولوجية للخلية. ثم، تطبيق شفط عابرة ورقيقة على ماصة صغيرة لتمزق الغشاء وخلق تكوين خلية كاملة جيدة. سجل خصائص اطلاق النار عن طريق اختبار نمط اطلاق النار من كل خلية عصبية في المشبك الحالي مع سلسلة من ثانية واحدة البقول الحالية depolarizing من 25 إلى 150 picoamps مع 25 زيادات picoamp في احتمال غشاء يستريح.

لتسجيل التيارات subthreshold الجسدية، عقد احتمالية الغشاء في ناقص 50 millivolts في وضع المشبك الجهد ثم تطبيق سلسلة من نبضات الجهد فرط الاستقطاب لمدة ثانية واحدة من ناقص 60 ملليفولت إلى ناقص 120 millivolts مع 10 ميليفولت 10. سجل التيارات ما بعد متشابك الإثارة مع أيون البوتاسيوم القائمة على حل داخل الخلايا في وضع المشبك الجهد في عقد المحتملة من ناقص 70 millivolts. سجل IPSC باستخدام محلول أيونات أسّس داخل الخلايا لتسجيل IPSC.

بعد عقد الغشاء المحتملة في ناقص 70 millivolts لمدة خمس دقائق تقريبا، تدريجيا تغيير احتمال عقد إلى ميليفولت صفر. انتظر بضع دقائق لتحقيق الاستقرار ثم قم بالبدء في تسجيل أحداث IPSC. أنماط اطلاق النار التي تحددها حقن سلسلة من ثانية واحدة البقول الحالية depolarizing في الخلايا العصبية SG في احتمال غشاء يستريح يمكن تصنيفها على أنها منشط اطلاق النار، وتأخير اطلاق النار، والفجوة اطلاق النار، الأولية انفجار، رشق phasic الانفجار، واحد- مسمار ومتردد اطلاق النار.

تُظهر هذه الصورة بروتوكول استحضار التيارات subthreshold في المشبك الجهد. وتظهر هذه الآثار التمثيلية الاستجابة لحقن التيار المفرط في الأقطاب المصنفة على أنها IH وIA و IT. هذا هو أثر تمثيلي لـ SEPSC المسجلة من الخلايا العصبية SG في ناقص 70 ملليفولت في غياب ووجود 50 APV ميكرومولار و 20 CNQX ميكرومولار. يظهر هذا التتبع في SEPC المسجلة قبل إضافة APV و CNQX على مقياس زمني موسع.

بعد هذا الإجراء هي أساليب مثل تسجيلات المشبك التصحيح الاقتران أو optogenetics يمكن تنفيذها للإجابة على أسئلة إضافية مثل وصف الدوائر الدقيقة العصبية محددة في substantia الجيلاتينوزا.