Name: العزلة، وتثبيت، وتصوير الفلورة الغدد الكظرية الماوس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: تعلم عزل الغدد الكظرية في الفئران وتثبيتها وتصويرها بالفلورة المناعية لدراسة التنظيم الطبقي وهوية الخلايا. هذه التقنية تحافظ على مورفولوجيا الأنسجة وتتيح تحليل بروتينات متعددة في علم الأحياء الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونشكر الدكتور محمد الزبير على اقتراحاته المفيدة والمساعدة التقنية في وضع هذا البروتوكول. كان يدعمها هذا العمل في المعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي، وأمراض الكلي، "معاهد الصحة الوطنية لمنحه بحثية" 2R01-DK062027 (إلى G.D.H).

<ol><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+power+of+immunohistochemistry+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).</li>
<li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/10.3181/00379727-47-13084P">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Stem%2F+Progenitor+Cell+Maintenance+in+the+Adrenal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li>
<li>Yates, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+Development%2C+Maintenance%2C+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Gland+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease.</a> Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).</li>
<li>Jones, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+Mouse+Adrenal+Cortex+with+Special+Reference+to+the+Zona+Reticularis+and+to+Brown+Degeneration%2C+Together+with+a+Discussion+of+the+Cell+Migration+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Journal+of+Microscopical+Science%22%5BJournal%5D)">Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory.</a> Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53(1948).</li>
<li>Sucheston, M. E. C., Samuel, M. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/e6f2/ef2e1761e7eb22ceeca818610ff152539fbe.pdf">The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland.</a> The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).</li>
<li>Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Sonic+hedgehog+secreting+and+receiving+cells+in+the+developing+and+adult+rat+adrenal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).</li>
<li>Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+zonation%2C+renewal%2C+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling.</a> Frontiers in Endocrinology. 6, 27(2015).</li>
<li>Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Droplets+Finally+Get+a+Little+R-E-S-P-E-C-T%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li>
<li>Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26639173">Lipid droplets and steroidogenic cells.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).</li>
<li>Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25668018">Hedgehog signaling and steroidogenesis.</a> Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).</li>
<li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li>
<li>Lowe, J., Anderson, P. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/stevens-and-lowes-human-histology-fourth-edition/9780723435020">Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition</a>. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).</li>
<li>Nagatsu, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1684650">Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes.</a> Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).</li>
<li>Berthon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+effects+of+Armc5+haploinsufficiency+on+adrenocortical+function%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Geneticst%22%5BJournal%5D)">Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function.</a> Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).</li>
<li>Brown, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9864103">Antigen retrieval methods for immunohistochemistry.</a> Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).</li>
<li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+wood+through+the+trees%3A+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li>
<li>Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+fluorometric+determination+of+the+stable+state+of+aggregation+in+hemoglobins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins.</a> Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).</li>
<li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Red+Blood+Cell+Autofluorescence+for+Immunocytochemistry+on+Fixed+Embryonic+Mouse+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 28(2017).</li>
<li>Watson, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21391776">Suppressing autofluorescence of erythrocytes.</a> Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207(2011).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

ويصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل الغدد الكظرية الماوس جنبا إلى جنب مع الإعداد وتلطيخ للغدة الكظرية مقطعة الماوس جزءا لا يتجزأ من البارافين.
بالمقارنة مع البروتوكولات الأخرى نحن اختبار، أثبت هذا البروتوكول الفلورة مناسبة لمعظم الأجسام المضادة المستخدمة في المختبر. ومع ذلك، في بعض الحالات قد يتطلب الأمر إجراء بعض التعديلات لتحسين نتائج المصبوغة. وهو متغير واحد يمكن بسهولة تعديل واختبارها مدة التثبيت. في المختبر، الحضانة في 4% منهاج العمل يمكن أن تختلف من ح 1 إلى ح 4، بينما في مختبرات أخرى هو تمديد...

إيمونوهيستوتشيميستري أسلوب للكشف عن مكونات النسيج باستخدام أجسام مضادة محددة من الجزيئات الخلوية وتقنيات المصبوغة اللاحقة للكشف عن الأجسام المضادة مترافق1. يتطلب هذا الإجراء المناعي التثبيت المحددة وتجهيز الأنسجة التي تتحدد غالباً تجريبيا مستضد معين، استخدام أنسجة وجسم2. تثبيت أمر حاسم للحفاظ على حالة الأنسجة وبالتالي الحفاظ على هياكل سوبسيلولار والخلوية سليمة وأنماط التعبير "الأصلي". كذلك تجهيز وتضمين إجراءات مطلوبة لإعداد الأنسجة لتمزيقها إلى شرائح رقيقة التي يتم استخدامها لدراسات نسيجية التي تنطوي على إيمونوهيستوتشيميستري.
يمكن إجراء إيمونوستاينينج مع الكشف اللونية أو الفلورسنت. كشف اللونية يتطلب استخدام إنزيم تحويل ركيزة القابلة لذوبان إلى منتج ملونة غير قابلة للذوبان. بينما يمكن مترافق هذا الإنزيم إلى جسم إذ تسلم المستضد (جسم الأولية)، هو أكثر في كثير من الأحيان مترافق بجسم الاعتراف بجسم الأولية (أي، جسم الثانوي). هذا الأسلوب حساسة للغاية؛ المنتج الملونة الناتجة عن رد فعل الانزيمية فوتوستابل ويتطلب إلا مجهر برايتفيلد للتصوير. ومع ذلك، إيمونوستينينج اللونية قد لا تكون مناسبة عندما تحاول أن تصور البروتينات هما ترجمة المشترك، نظراً للترسب لون واحد يمكن أن تخفي ترسب واحدة أخرى. في حالة الاشتراك تلطيخ، أثبت الفلورة لتكون أكثر فائدة. ويعزى ظهور الفلورة "ألبرت كونس" وزملائه، الذين وضعت نظاما لتحديد المستضدات الأنسجة مع الأجسام المضادة التي تحمل فلوريسسين وتصور لهم في الأنسجة مقطعة تحت الضوء فوق البنفسجي3. وتستند الأسفار الكشف عن جسم مترافق مع فلوروفوري التي تنبعث الضوء بعد الإثارة. لأن هناك عدة فلوروفوريس مع الانبعاثات عند أطوال موجية مختلفة (مع تداخل قليلاً أو لا)، طريقة الكشف عن هذا المثل الأعلى للدراسات الخاصة بالبروتينات متعددة.
الغدة الكظرية جهاز المزدوجة الموجودة فوق الكلي، وتتميز بعنصرين متميزين امبريولوجيكالي محاطة بكبسولة الوسيطة. قشرة الغدة الكظرية الخارجي، المستمدة من ميسوديرم المتوسطة ميسونيفريك، تفرز هرمونات الستيرويد بينما تنتج لب الداخلية، المستمدة من قمة العصبية، الكاتيشولامين بما فيها الأدرينالين ونورادرينالين والدوبامين. قشرة الغدة الكظرية ينقسم الأشيع ووظيفيا في ثلاث مناطق متحدة المركز، مع كل منطقة إفراز فئات مختلفة من هرمونات الستيرويد: الخارجي zona glomerulosa (زج) تنتج مينيرالوكورتيكويدس التي تنظم التوازن المنحل بالكهرباء و حجم داخل الأوعية؛ فاسسيكولاتا زونا الأوسط (zF)، مباشرة تحت زج، تفرز الكورتيزون التي تتوسط استجابة الإجهاد من خلال تعبئة مخازن الطاقة لزيادة جلوكوز البلازما؛ وقد زونا الداخلية (zR)، الذي يجمع الجنس السلائف الستيرويد (أي، وديهيدرو (داس))4.
يوجد بعض الاختلاف في تقسيم البطاني بين الأنواع: فعلى سبيل المثال، يفتقر موس موسكولوس zR. العاشر بعد الولادة الفريدة-منطقة موسكولوس م. من بقايا من قشرة الجنين تتميز بالخلايا الدهنية-الفقراء الصغيرة مع سيتوبلاسمس acidophilic5. س-المنطقة يختفي في سن البلوغ في الفئران الذكور وبعد الحمل الأول في الفئران الإناث، أو يتدهور تدريجيا في الإناث التي ولدت عدم6،7. وعلاوة على ذلك، تورتوسيتي وسمك المعروضات زج علامة التباين بين الأنواع كما يفعل منظمة للخلايا الجذعية والسلف المحيطية في وزج المناطق المجاورة لها. الفئران، خلافا لسائر القوارض، لدى منطقة غير متمايزة مرئية (زو) بين زج و zF التي تعمل كمنطقة خلايا الجذعية و/أو منطقة عابرة تضخيم موروث. ما إذا كان زو فريدة من نوعها للفئران أو ببساطة أكثر بارزة نظمت مجموعة من الخلايا هو غير معروف8،9.
تحتوي الخلايا للقشرة الكظرية قطرات الدهن التي تخزن استرات الكوليسترول التي تكون بمثابة مقدمة لجميع هرمونات الستيرويد10،11.  ويعرف مصطلح "ستيرويدوجينيسيس" عملية إنتاج هرمونات الستيرويد من نسبة الكولسترول في الدم عن طريق سلسلة من التفاعلات الانزيمية التي تنطوي على نشاط عامل ستيرويدوجينيك 1 (SF1)، التعبير الذي علامة على إمكانات ستيرويدوجينيك. في الغدة الكظرية، التعبير Sf1 موجودة فقط في خلايا اللحاء12. دراسة مثيرة لاهتمام وجدت التعبير عن البيوتين الذاتية في الخلايا البطاني مع احتمال ستيرويدوجينيك13. بينما يمكن أن يكون هذا سبب خلفية أعلى في أساليب المصبوغة البيوتين/المستندة إلى ستريبتافيدين، بسبب الكشف عن البيوتين الذاتية بجسم مترافق مع streptavidin، وهذه الخاصية يمكن استخدامها أيضا للتمييز في ستيرويدوجينيك خلايا من السكان الآخرين داخل الغدة الكظرية، أي، بطانية، والحافظة، وخلايا لب.
معصب من يتعاطف مع الخلايا العصبية بريجانجليونيك، الكظر تتسم بالخلايا باسوفيليك مع السيتوبلاسما حبيبية تتضمن أدرينالين وإفراز. خلايا لب تسمى "تشرومافين" بسبب ارتفاع محتوى الكاتيشولامين التي تشكل صبغة بني بعد أكسدة14. Hydroxylase التيروزين (TH) هو الإنزيم الذي يحفز الخطوة الحد من معدل في تركيب الكاتيشولامين، وفي الغدة الكظرية، وهو أعرب عن فقط في لب15.
نقدم هنا بروتوكولا لعزل الماوس الغدد الكظرية، تجهيزها للتضمين في البارافين وتمزيقها وأسلوب أداء الفلورة تلطيخ في الفروع الكظرية بغية التعرف على أنواع الخلايا التي تشكل قشرة الغدة الكظرية ولب. هذا البروتوكول معيار في المختبر إيمونوستينينج مع الأجسام المضادة متعددة تستخدم بشكل روتيني في بحوثنا.

<table><tbody><tr><td>24 بئر لوحة زراعة الخلايا</td><td>Nest Biotechnology Co.</td><td>0412B</td><td></td></tr><tr><td>إبر يمكن التخلص منها 25 جم × 5/8 بوصة</td> <td>Exel International</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>Sigma-Aldrich &nbsp ؛</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus&nbsp;</td><td>ماكورميك</td><td>39502004</td><td>العلمي بارافين لتضمين الأنسجة</td></tr><tr><td>أشرطة خزعة شاندون II مع غطاء مرفق</td><td>كاسيت 1001097 علمي حراري</td><td></td><td>لمعالجة الأنسجة</td></tr><tr><td>شفرات ميكروتوم عالية</td><td>المستوى Accu-Edge</td><td>4685</td><td>شفرات من الفولاذ المقاوم للصدأ يمكن التخلص</td></tr><tr><td>منها قوالب تضمين الأنسجة البلاستيكية التي يمكن التخلص منها Polysciences</td><td>Inc.</td><td>18986</td><td>مقطوعة ، 22 مم مربع أعلى مدبب إلى 12 مم أسفل</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>75 مم × 25 مم × 1 مم</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X5P1GAL&nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>200 دليل على مختبرات الإيثانول</td><td>ديكون ، إنك.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>وسادات شاش Certi-Pad&nbsp;</td>معتمد <td>السلامة Mfg، Inc</td><td>231-210</td><td>3 "× 3. وسادات شاش معقمة خالية من اللاتكس</td></tr><tr><td>مجموعة MOM &nbsp;</td><td>مختبرات ناقلات</td><td>BMK-2202</td><td>للكشف عن الأجسام المضادة الأولية للفأر على أنسجة الفأر</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td></td><td>KimTech 34155</td><td>مناديل مبللة 4.4 بوصة × 8.4 بوصة</td></tr><tr><td>Super PAP PEN</td><td>Invitrogen &nbsp;</td><td>00-8899</td><td>قلم للرسم على الشرائح زجاج</td></tr><tr><td>غطاء المجهر&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-D</td><td>الحجم: 22 × 50 × 1.5</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542 &nbsp ؛</td><td>(محضر في مخزون 20 مجم / مل)</td></tr><tr><td>ProLong Gold الكاشف المضاد للتلاشي</td><td>المجسات الجزيئية</td><td>P36930</td><td>عامل تركيب للتألق المناعي</td></tr> سلسلة <tr><td>X-cite 120Q</td><td>Lumen Dynamics</td><td></td><td>مصدر الضوء</td></tr><tr><td>Coolsnap Myo</td><td>Photometrics</td><td></td><td>Camera</td></tr><tr><td>Optiphot-2 & nbsp ؛</td><td>نيكون</td><td></td><td>المجهر</td></tr><tr><td>ميكروتوم</td><td>الأنسجة البصرية الأمريكية</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>المدمجة Leica</td><td>EG1150 H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>معالج الأنسجة&nbsp;</td><td>Leica</td><td>ASP300S</td><td></td></tr><tr><td>مصل الماعز العادي</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>الفأر المضاد ل TH</td><td>Millipore</td><td>MAB318</td><td>الجسم المضاد الأساسي</td></tr><tr><td>للأرانب المضادة ل SF1</td><td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td> <td>&nbsp; الأجسام</td><td>المضادة الأولية</td></tr><tr><td>المصنوعة حسب الطلب Alexa-488 Mouse IgG & nbsp ؛ الماعز الذي أثار</td><td>جاكسون ImmunoResearch</td><td>115-545-003 &nbsp ؛</td><td>الجسم المضاد الثانوي</td></tr><tr><td>Dylight-549 Rabbit IgG تربية الماعز</td><td>جاكسون ImmunoResearch</td><td>111-505-003</td><td>الأجسام المضادة الثانوية</td></tr><tr><td>حمض السترات اللامائي</td><td>فيشر الكيميائية</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Basic Research&nbsp;</td>برنامج <td>نيكون</td><td></td><td>للتصوير</td></tr></tbody></table>

العزلة، وتثبيت، وتصوير الفلورة الغدد الكظرية الماوس

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

تقنية راسخة للكشف عن المستضدات في الأنسجة مع عمل الأجسام المضادة مترافق fluorochrome الفلورة ولديها مجموعة واسعة من التطبيقات. الكشف عن المستضدات يسمح لتوصيف وتحديد العديد من أنواع الخلايا. تقع فوق الكليتين ومغلفة بطبقة من الخلايا الوسيطة، الغدة الكظرية جهاز الغدد الصماء تتألف من اثنين من أنسجة مختلفة مع مختلف الأصول الجنينية وميسونيفريك المتوسطة mesoderm-مشتقة الخارجي قشرة العصبية لب الداخلية المستمدة من كريست. تفرز قشرة الغدة الكظرية المنشطات (أي، مينيرالوكورتيكويدس، والكورتيزون، الهرمونات الجنسية)، في حين الكظر تنتج الكاتيشولامين (أي، الأدرينالين، نورادرينالين). أثناء إجراء البحوث الغدة الكظرية، من المهم أن تكون قادرة على التمييز بين خلايا فريدة من نوعها مع وظائف مختلفة. هنا نقدم بروتوكول وضعت في المختبر الذي يصف سلسلة من الخطوات المتسلسلة المطلوبة للحصول على تلطيخ الفلورة لوصف أنواع خلايا الغدة الكظرية. ونحن نركز أولاً على تشريح الغدد الكظرية الماوس، إزالة الدهون بيريادرينال متبوعاً بالتثبيت، وتجهيز وتضمين البارافين الأنسجة المجهرية. ثم يصف لنا تقطيع كتل الأنسجة مع مبضع دوارة. وأخيراً، نحن تفاصيل بروتوكول لتلطيخ إيمونوفلوريسسينت الغدد الكظرية التي قمنا بتطوير لتقليل جسم غير محددة ملزمة وأوتوفلوريسسينسي من أجل تحقيق إشارة أمثل.

ويمثل الشكل 1 تخطيطي بروتوكول كامل الموصوفة أعلاه. الغدد الكظرية يتم حصادها من الفئران وتتم إزالة الأنسجة الدهنية المجاورة تحت مجهر تشريح الغدة الكظرية ثم ثابتة في 4% منهاج عمل بيجين. بعد هذه الخطوة، معالجة الغدة الكظرية وجزءاً لا يتجزأ من البارافين، ومقطوع مع مبضع قطع الجهاز إلى شرائح رقيقة وتودع في شرائح المجهر. بعد تجفيف الأقسام، ينفذ الفلورة والأقسام يتم تصويرها في المجهر.
إزالة الدهون المجاورة ...

هنا نقدم طريقة لعزل الغدد الكظرية من الفئران، وإصلاح الأنسجة، وقسم منهم، وأداء تلطيخ الفلورة.

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

إنّ الفلور المناعية هي طريقة أساسية يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الغدة الكظرية حول تقسيم الكظرية وهوية الخلية والوظيفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة البروتينات المتعددة مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة الكظرية. لإزالة الغدة الكظرية مورين، وقطع حول الأنسجة الدهنية المحيطة ووضع الغدة في بئر واحد من لوحة متعددة 24 التي تحتوي على برنامج تلفزيوني جديد على الجليد.نقل الغدة على طبق بيتري أو دعم الزجاج تحت مجهر تشريح واستخدام اثنين من الإبر قياس 25 لإزالة الأنسجة الدهنية المجاورة. عندما تم إزالة كل من الدهون، إصلاح الأنسجة في 4٪ شبهformaldehyde في أربع درجات مئوية مع هزاز لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة ، شطف الغدة مع ثلاثة غسل 15 دقيقة في أربع درجات مئوية في ملليلتر واحد إلى اثنين من برنامج تلفزيوني جديد في الغسيل.بعد الغسيل الأخير ، قم بتجفيف الغدة في غطستين من الإيثانول المتتابعة عند أربع درجات مئوية مع الهزاز لمدة ساعتين لكل حضانة. لتحضير النسيج الكظري للمعالجة، لف الغدة بالشاش وأرفق الغدة الكظرية في كاسيت مضمّن للأنسجة. ثم، ضع الكاسيت في جرة مليئة بالإيثانول 70٪ لمدة أربع درجات مئوية التخزين حتى المعالجة.لمعالجة الأنسجة، أدخل الكاسيت في معالج الأنسجة للمعالجة كما هو مبين في الجدول. في نهاية البرنامج، نقل الكاسيت إلى محطة تضمين مليئة البارافين ذاب 65 درجة واستخدام زوج من ملقط لفك الشاش. نقل بلطف الغدة الكظرية في الموقف المناسب في وسط قاعدة من العفن تضمين وصب البارافين ذاب على الغدة.ثم، نقل بعناية العفن تضمين إلى علبة تبريد لتسهيل تصلب البارافين. قبل قسمة ب [ميكرومّ] دوارة, صمّم [سري] من مجهر زلقات ووضع الشرائح على 37 درجة مئويّة انزلاق أكثر دفئا. الاستغناء عن حوالي 450 ميكرولترات من نوع autoclaved واحد المياه النقية جدا على كل شريحة وتعيين سمك قطع القسم من microtome إلى خمسة ميكرومتر.قم بتحميل الأنسجة المضمّنة على كتلة القطع وخفض كتلة البارافين حتى تكون العينة على مستوى الوجه مع حافة شفرة المايكروتوم. تدوير عجلة اليد مع إيقاع ثابت، وتنفيذ التشذيب الأولي لإزالة البارافين وفضح الأنسجة الكظرية. ثم، الحصول على خمسة أقسام ميكرومتر من خلال نهاية الغدة الكظرية باستخدام ملقط لنقل كل قسم إلى قطرة الماء على واحدة من الشرائح المسماة مسبقا كما يتم جمعها.بعد التأكد من وجود الأنسجة في الأقسام عن طريق المجهر، جفف الشرائح على الصفيحة الساخنة لمدة ساعتين تقريباً واخبزها بين عشية وضحاها على الأقل على صينية شرائح عند درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى لا يظهر المزيد من الماء. بمجرد التجفيف، قم بتخزين الشرائح في مربع شريحة في درجة حرارة الغرفة. لاسترجاع مستضد المناعة، de-paraffinize الشرائح مع اثنين من خمس دقائق 100٪ غوليين، تليها الإماهة في سلسلة الإيثانول الغمر تنازلي والمياه.بعد غمر الماء، نقل الشرائح إلى حامل الشريحة المعدنية ووضع حامل في منبر من 0.01 هرات الغلي على لوحة ساخنة لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة، وإزالة الكدر من لوحة ساخنة والسماح لها تبرد لمدة 20 دقيقة، مع الحرص على أن جميع أقسام الغدة الكظرية لا تزال مغطاة العازلة. عندما يتم تبريد الكوبر، نقل الشرائح إلى جرة كوبلين لمدة ثلاثة غسلات لمدة 10 دقائق في PBS الطازجة مع هزاز لطيف.بعد الغسيل الأخير، امسح بعناية سطح كل شريحة دون إتلاف أقسام الأنسجة واستخدم علامة رهاب الماء لجعل دائرة حول كل قسم. ضع الشرائح في غرفة مرطبة وأضف بسرعة 50 ميكرولترات على الأقل من محلول الحجب إلى كل قسم لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة منع، غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني جديد لمدة خمس دقائق لكل غسل مع هزاز والعودة الشرائح إلى الغرفة.بعد ذلك، أضف مزيج الأجسام المضادة الأساسي الذي يهم كل قسم لاحتضانها بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، قم بغسل العينات بثلاث غسلات لمدة 15 دقيقة في برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل وتسمية الشرائح مع محلول الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع ثلاثة غسل 15 دقيقة على الروك المحمية من الضوء، ووضع علامة على نواة من الأقسام مع DAPI لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء بعد الغسيل الماضي.بعد ثلاثة خمس دقائق برنامج تلفزيوني يغسل مع هزاز، إضافة 60 microliters من عامل تصاعد مناسبة لمناعة الزجاج على طول سطح واحد غطاء الزجاج لكل عينة واضغط بخفة كل شريحة شريحة قسم الأنسجة الجانب إلى أسفل على الزجاج غطاء، مع الحرص على تجنب فقاعات. ثم، وضع كل شريحة مسطحة في حاوية مظلمة لعلاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التصوير. خلال عملية إزالة الدهون، من المهم عدم السماح للغدة الكظرية بالجفاف حيث يمكن أن يؤدي الجفاف إلى تلف بنية الأنسجة.بعد إزالة ناجحة من الأنسجة الدهنية المحيطة, يجب أن تكون الغدة الكظرية يمكن اكتشافها بسهولة مع عدم وجود الدهون مرئية إضافية. المناعة من أقسام الغدة الكظرية كما هو موضح يكشف عن عامل الستيرويدية النووية واحدة تلطيخ من الخلايا الغدة الدرقية, تلطيخ التيروزين هيدروكسيلاس من خلايا النخاع, تلطيخ DAPI من نواة الخلايا غير الستيرويدية من الكبسولة الخارجية, وشارك في تلطيخ مع الخلايا الغدة الدرقية ونخاع. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن الغدة الكظرية الماوس صغيرة وأن مواقفها متغيرة إلى حد ما مما يجعل اكتشافها صعباً.لذلك ، من المهم أن يكون لديك رؤية واضحة للمنطقة أثناء التشريح. هذه الإجراءات هي التقنيات الأساسية لدراسة الغدة الكظرية في الجسم الحي. وبعد ذلك، يمكن تنفيذ أساليب إضافية لاحتواء المناعة لتلبية احتياجات علمية محددة.بعد تطورها، مهدت المناعة الطريق للباحثين في مجالات العلوم الطبية الحيوية لاستكشاف التعبير البروتيني في الموقع، وهو أداة مفيدة في العديد من التخصصات والمجالات.

isolation-fixation-immunofluorescence-imaging-mouse-adrenal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

نظم أليف للكروم الكظرية خلية ثقافة النخاعية مفيدة للغاية لدراسة الإثارة ، في إفراز اقتران في وضع المختبر. هذا البروتوكول يوضح الطريقة التي استخدمت لتشريح الغدة الكظرية ثم عزل المنطقة النخاعية بتجريد بعيدا القشرة الكظرية. ويتجلى ذلك في الهضم من النخاع إلى خلايا أليفة الكروم واحد.

خلية فأر أليف للكروم عزل الكظرية

يوضح هذا الفيديو فحصا لإجراء تلطيخ مناعي متعدد الإرسال باستخدام الأجسام المضادة الأولية من نفس الأنواع المضيفة. في هذه الطريقة ، يخضع قسم أنسجة الغدة الكظرية لعملية تلطيخ مناعي من خطوتين. في البداية ، يتم تلطيخ القسم بأجسام مضادة خاصة بعلامات في القشرة ، متبوعا بتجريد الجسم المضاد المرتبط وإعادة تلطيخه بالأجسام المضادة الخاصة بالعلامات في النخاع.

طريقة تللوين مناعي متعددة الإرسال باستخدام الأجسام المضادة الأولية من نفس الأنواع المضيفة

ويتحقق عالية الدقة حيوي داخلي التصوير مع تعزيز النقيض تصل إلى 120 ميكرومتر في عمق الغدد الليمفاوية من الفئران الكبار عن طريق تحوير مكانيا نمط الإثارة من متعدد التنسيق المجهر ثنائي الفوتون. في عمق 100 ميكرون قمنا بقياس قرارات من 487 نانومتر (الأفقي) و 551 نانومتر (المحوري)، وبالتالي الالتفاف على تشتت وحيود حدود.

حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

بعد إفراز الخلايا ، يتم استرداد غشاء البلازما المنصهر من خلال عملية تعرف باسم الالتقام الخلوي. تعمل هذه الآلية على إصلاح الحويصلات المشبكية الجديدة للجولة التالية من الإصدار. يتم التقاط الأحداث الداخلية الفردية وتحليلها من خلال استخدام تسجيلات السعة المرتبطة بالخلية في خلايا كرومافين الغدة الكظرية في الفأر.

طرق الخلية المرفقة قياسات السعة في ماوس الكظرية أليف الكروم خلية

بروتوكول المناعي غير المباشر الموضحة في هذه المقالة يسمح للكشف وتوطين البروتينات في الغدة الثديية الماوس. ويرد طريقة الكامل لتحضير عينات الغدة الثديية، لأداء المناعية، لصورة أقسام الأنسجة بواسطة المجهر مضان، وإعادة بناء الصور.

المناعي غير المباشر على أقسام المجمدة من الماوس الغدة الثديية

ونحن نقدم وسيلة لعزل وثقافة قناة وولف الماوس (WD). نحن أيضا يبرهن على وجود إجراءات مفصلة لجبل بأكمله المناعية من WDS مثقف / المعزولة حديثا مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا، وتمكن هذه التقنيات دراسة التطور WD، اللف، والتمايز.

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

نقدم بروتوكولا لتشريح الغدد النخامية وإعداد أقسام الاكليلية الغدة النخامية من الفئران البلدان النامية.

تشريح وإعداد شريحة الاكليلية وضع الغدة النخامية الماوس

وقد تم وضع عدة طرق مختلفة لتلطيخ المناعة المتعددة باستخدام الأجسام المضادة الأولية من نفس الأنواع المضيفة. هنا ، نصف استخدام تجريد الأجسام المضادة بوساطة الميكروويف وفلوروفور -التياراميد لمنع تفاعل الأجسام المضادة أثناء تلطيخ المناعة المتعدد على أقسام الغدة الكظرية للفئران الثابتة من البارافين الثابتة.

الميكروويف والفلوروفور- التيراميد للتلطيخ المناعي المتعدد على الغدة الكظرية للفأر - باستخدام الأجسام المضادة الأولية غير المُهمة من نفس الأنواع المضيفة

يصف هذا البروتوكول تقنية تصوير متحدة البؤرة للكشف عن ثلاثة أوضاع اندماج في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية. تشمل أوضاع الاندماج هذه 1) الانصهار الوثيق (ويسمى أيضا القبلة والتشغيل) ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الانصهار ، 2) الاندماج ، الذي ينطوي على فتح مسام الاندماج والحفاظ على المسام المفتوحة ، و 3) الانصهار الانكماشي ، الذي ينطوي على انكماش الحويصلة المنصهرة.

المجهر البؤري لقياس ثلاثة أنماط من ديناميكيات مسام الانصهار في خلايا الكرومافين الكظرية

يحدد هذا البروتوكول عزل الأسلاف الليفية العضلية الهيكلية والقلبية (FAPs) من الفأر الشوكي (Acomys) عن طريق التفكك الأنزيمي وفرز الخلايا المنشطة بالتألق. يمكن توسيع FAPs التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول بشكل فعال وتمييزها إلى الخلايا الليفية العضلية والخلايا الشحمية.

عزل السلف الليفي الأديبوجيني والتوسع والتمايز عن نموذج الفأر الشوكي

تم تطوير نهج قوي وقابل للتكرار لإنشاء الثقافات الأولية ثنائية الأبعاد لخلايا المنطقة الغنية بالزونا كبيبات والمنطقة الحامية للقشرة الكظرية للفأر. يحافظ هذا النظام على الخصائص الجزيئية والوظيفية الرئيسية لكل منطقة، مما يتيح دراسة مركزة لمسارات الإشارات، وإنتاج الهرمونات، وسلوك الخلايا القشرية الكظرية خارج الجسم الحي.

تأسيس الثقافات الأولية الغنية بالمناطق من قشرة الغدة الكظرية للفأر

تعلم عزل الغدد الكظرية في الفئران وتثبيتها وتصويرها بالفلورة المناعية لدراسة التنظيم الطبقي وهوية الخلايا. هذه التقنية تحافظ على مورفولوجيا الأنسجة وتتيح تحليل بروتينات متعددة في علم الأحياء الخلوي.

العزلة، وتثبيت، وتصوير الفلورة الغدد الكظرية الماوس

استكشف المزيد من الفيديوهات