العزلة، وتثبيت، وتصوير الفلورة الغدد الكظرية الماوس

إنّ الفلور المناعية هي طريقة أساسية يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الغدة الكظرية حول تقسيم الكظرية وهوية الخلية والوظيفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة البروتينات المتعددة مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة الكظرية. لإزالة الغدة الكظرية مورين، وقطع حول الأنسجة الدهنية المحيطة ووضع الغدة في بئر واحد من لوحة متعددة 24 التي تحتوي على برنامج تلفزيوني جديد على الجليد.

نقل الغدة على طبق بيتري أو دعم الزجاج تحت مجهر تشريح واستخدام اثنين من الإبر قياس 25 لإزالة الأنسجة الدهنية المجاورة. عندما تم إزالة كل من الدهون، إصلاح الأنسجة في 4٪ شبهformaldehyde في أربع درجات مئوية مع هزاز لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة ، شطف الغدة مع ثلاثة غسل 15 دقيقة في أربع درجات مئوية في ملليلتر واحد إلى اثنين من برنامج تلفزيوني جديد في الغسيل.

بعد الغسيل الأخير ، قم بتجفيف الغدة في غطستين من الإيثانول المتتابعة عند أربع درجات مئوية مع الهزاز لمدة ساعتين لكل حضانة. لتحضير النسيج الكظري للمعالجة، لف الغدة بالشاش وأرفق الغدة الكظرية في كاسيت مضمّن للأنسجة. ثم، ضع الكاسيت في جرة مليئة بالإيثانول 70٪ لمدة أربع درجات مئوية التخزين حتى المعالجة.

لمعالجة الأنسجة، أدخل الكاسيت في معالج الأنسجة للمعالجة كما هو مبين في الجدول. في نهاية البرنامج، نقل الكاسيت إلى محطة تضمين مليئة البارافين ذاب 65 درجة واستخدام زوج من ملقط لفك الشاش. نقل بلطف الغدة الكظرية في الموقف المناسب في وسط قاعدة من العفن تضمين وصب البارافين ذاب على الغدة.

ثم، نقل بعناية العفن تضمين إلى علبة تبريد لتسهيل تصلب البارافين. قبل قسمة ب [ميكرومّ] دوارة, صمّم [سري] من مجهر زلقات ووضع الشرائح على 37 درجة مئويّة انزلاق أكثر دفئا. الاستغناء عن حوالي 450 ميكرولترات من نوع autoclaved واحد المياه النقية جدا على كل شريحة وتعيين سمك قطع القسم من microtome إلى خمسة ميكرومتر.

قم بتحميل الأنسجة المضمّنة على كتلة القطع وخفض كتلة البارافين حتى تكون العينة على مستوى الوجه مع حافة شفرة المايكروتوم. تدوير عجلة اليد مع إيقاع ثابت، وتنفيذ التشذيب الأولي لإزالة البارافين وفضح الأنسجة الكظرية. ثم، الحصول على خمسة أقسام ميكرومتر من خلال نهاية الغدة الكظرية باستخدام ملقط لنقل كل قسم إلى قطرة الماء على واحدة من الشرائح المسماة مسبقا كما يتم جمعها.

بعد التأكد من وجود الأنسجة في الأقسام عن طريق المجهر، جفف الشرائح على الصفيحة الساخنة لمدة ساعتين تقريباً واخبزها بين عشية وضحاها على الأقل على صينية شرائح عند درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى لا يظهر المزيد من الماء. بمجرد التجفيف، قم بتخزين الشرائح في مربع شريحة في درجة حرارة الغرفة. لاسترجاع مستضد المناعة، de-paraffinize الشرائح مع اثنين من خمس دقائق 100٪ غوليين، تليها الإماهة في سلسلة الإيثانول الغمر تنازلي والمياه.

بعد غمر الماء، نقل الشرائح إلى حامل الشريحة المعدنية ووضع حامل في منبر من 0.01 هرات الغلي على لوحة ساخنة لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة، وإزالة الكدر من لوحة ساخنة والسماح لها تبرد لمدة 20 دقيقة، مع الحرص على أن جميع أقسام الغدة الكظرية لا تزال مغطاة العازلة. عندما يتم تبريد الكوبر، نقل الشرائح إلى جرة كوبلين لمدة ثلاثة غسلات لمدة 10 دقائق في PBS الطازجة مع هزاز لطيف.

بعد الغسيل الأخير، امسح بعناية سطح كل شريحة دون إتلاف أقسام الأنسجة واستخدم علامة رهاب الماء لجعل دائرة حول كل قسم. ضع الشرائح في غرفة مرطبة وأضف بسرعة 50 ميكرولترات على الأقل من محلول الحجب إلى كل قسم لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة منع، غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني جديد لمدة خمس دقائق لكل غسل مع هزاز والعودة الشرائح إلى الغرفة.

بعد ذلك، أضف مزيج الأجسام المضادة الأساسي الذي يهم كل قسم لاحتضانها بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، قم بغسل العينات بثلاث غسلات لمدة 15 دقيقة في برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل وتسمية الشرائح مع محلول الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع ثلاثة غسل 15 دقيقة على الروك المحمية من الضوء، ووضع علامة على نواة من الأقسام مع DAPI لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء بعد الغسيل الماضي.

بعد ثلاثة خمس دقائق برنامج تلفزيوني يغسل مع هزاز، إضافة 60 microliters من عامل تصاعد مناسبة لمناعة الزجاج على طول سطح واحد غطاء الزجاج لكل عينة واضغط بخفة كل شريحة شريحة قسم الأنسجة الجانب إلى أسفل على الزجاج غطاء، مع الحرص على تجنب فقاعات. ثم، وضع كل شريحة مسطحة في حاوية مظلمة لعلاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التصوير. خلال عملية إزالة الدهون، من المهم عدم السماح للغدة الكظرية بالجفاف حيث يمكن أن يؤدي الجفاف إلى تلف بنية الأنسجة.

بعد إزالة ناجحة من الأنسجة الدهنية المحيطة, يجب أن تكون الغدة الكظرية يمكن اكتشافها بسهولة مع عدم وجود الدهون مرئية إضافية. المناعة من أقسام الغدة الكظرية كما هو موضح يكشف عن عامل الستيرويدية النووية واحدة تلطيخ من الخلايا الغدة الدرقية, تلطيخ التيروزين هيدروكسيلاس من خلايا النخاع, تلطيخ DAPI من نواة الخلايا غير الستيرويدية من الكبسولة الخارجية, وشارك في تلطيخ مع الخلايا الغدة الدرقية ونخاع. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن الغدة الكظرية الماوس صغيرة وأن مواقفها متغيرة إلى حد ما مما يجعل اكتشافها صعباً.

لذلك ، من المهم أن يكون لديك رؤية واضحة للمنطقة أثناء التشريح. هذه الإجراءات هي التقنيات الأساسية لدراسة الغدة الكظرية في الجسم الحي. وبعد ذلك، يمكن تنفيذ أساليب إضافية لاحتواء المناعة لتلبية احتياجات علمية محددة.

بعد تطورها، مهدت المناعة الطريق للباحثين في مجالات العلوم الطبية الحيوية لاستكشاف التعبير البروتيني في الموقع، وهو أداة مفيدة في العديد من التخصصات والمجالات.