قياس تفاعلات البروتينات كروي والخيطية مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) وعبارة ثيرموفوريسيس (MST)

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التفاعل البروتيني مثل ما إذا كان البروتين يرتبط بجزيء صغير أو كبير مباشرة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة بسيطة وسريعة للكشف عن التفاعلات المباشرة على المستوى الذري. تشغيل تدفق الهواء مع إخراج الأمر إخراج.

هذا سيجلب العينة من المغناطيس. الآن، ضع العينة داخل الدوار على رأس المغناطيس في الافتتاح. إدراج مع الأمر ij.

انتظر حتى تستقر العينة داخل المغناطيس قبل المتابعة. إنشاء مجموعة بيانات جديدة باستخدام الأمر edc وتحميل المعلمات NMR البروتون القياسي عن طريق تحديد التجربة ZGPR. تعبئة حقول "اسم" و"اختبار" و "معالجة حقول رقم مجلد البيانات.

حدد المذيب في حقل المذيبات تعيين وانقر على تنفيذ getprosol لقراءة probehead القياسية والمذيبات المعلمات التابعة. قفل العينة إلى المذيبات deuterated باستخدام أمر القفل والانتظار حتى يتم الانتهاء من كاسحة ويحقق قفل. تصحيح تردد الرنين من المغناطيس عن طريق ضبط العينة باستخدام atma الأمر ضبط التلقائي.

مراقبة منحنى تمايل حتى يتم الانتهاء من ضبط التلقائي. شيم المجال المغناطيسي باستخدام topshim. Shimming يجعل التكيف مع المجال المغناطيسي.

تحقيق التوحيد حول العينة. من الجيد تخزين هذا في القيم مع wsh الأمر ، وقراءتها باستخدام rsh قبل topshim ، إذا كان استخدام نفس أو نماذج مماثلة. الآن ضبط كسب المتلقي مع الأمر rga لتحقيق أقصى نسبة إشارة إلى الضوضاء.

ضع مركز الطيف على إزاحة الرنين المائي، وحدد نبض البروتون 90 درجة في طاقة عالية باستخدام calibo1p1. جمع طيف البروتون باستخدام صفر الذهاب zg الأمر وعملية مع efp. وهذا يشمل الضرب الأسي ، والاضمحلال التعريفي الحر الذي يتضمن توسيع الخط ، وتحويل Fourier من FID ، وpk لتطبيق تصحيح المرحلة.

تطبيق التصحيح التلقائي للمرحلة APK وتصحيح خط الأساس التلقائي absn باستخدام متعدد الحدود دون التكامل الخيار. إنشاء مجموعة بيانات جديدة لتجربة SOFAST HMBC عن طريق تحديد SFHMQC3GPPH في التجربة. انسخ P1 و O1 المحسنين من طيف البروتون و املأ نبضات P1 التابعة باستخدام الأمر getprosol plw1 plw1 ، حيث p1 هو القيمة المحسنة P1 ، وplw1 هو مستوى الطاقة P1. الآن، تحسين ثابت CNST54 لتعيين إزاحة لتحول الكيميائية أميد.

كما تحسين CNST55 لتحديد عرض النطاق الترددي من أجل أن تشمل المناطق الطيفية من الفائدة ، والسماح للمستلم كسب أن يكون الأمثل. لتحديد هذه المعلمات، استخراج أول FID من الطيف ثنائي الأبعاد والبحث عن إشارة الملاحظة لتحديدها. بالإضافة إلى ذلك ، تختلف عن تأخير الاسترخاء ، وعدد من التفحص ، والمسح الضوئي وهمية للحصول على حساسية إشارة مقبولة مع gs الأمر ، والتي تمكن من الذهاب والمسح الضوئي لمراقبة جودة البيانات في الوقت الحقيقي.

وأخيرا، تسجيل الأطياف باستخدام زيرو الذهاب زغ. تعيين معلمات المعالجة إلى حجم F2 الأبعاد المباشرة وF1 غير المباشرة من الطيف، مع التنبؤ الخطي اختياري في البعد غير المباشر. حدد QSINE كدالة النافذة وأدخل إزاحة جرس جيب جيب من اثنين لمعالجة الطيف ثنائي الأبعاد.

أدخل الأمر xfb لمعالجة البيانات في كلا الاتجاهين مع وظيفة النافذة والتحول Fourier. استخدم الأمر apk2d لتنفيذ تصحيح المرحلة التلقائي في كلا الاتجاهين. قم بتصحيح خط الأساس باستخدام وظيفة تصحيح الأساس التلقائية abs2 للبيانات 2D.

وهذا ينطبق على وظيفة متعددة الحدود بين قيم جزء في المليون المحددة في معلمات المعالجة، وسوف ينتج طيفاً 2D لمزيد من التحليل. إذا كان التخطيط لتنفيذ معالجة تسلسلية للمقارنة بين بيانات التفاعل مع جزيء آخر، تخزين معلمات المعالجة مع wpar الأمر واستدعائها مع rpar. أدخل الأمر pp لبدء عملية التقاط الذروة.

حدد نطاق جزء في المليون والحد الأدنى للكثافة والحد الأقصى لعدد القمم بناءً على القمم المتوقعة. ثم انقر فوق موافق. تحقق من النتائج بواسطة الفحص المرئي. إذا لزم الأمر، إعادة تشغيل العملية حتى النتائج مرضية على أساس جودة الأطياف.

إنشاء قائمة الذروة مع الأمر pp. تحتوي هذه القائمة الذروة على ارتفاع البيانات ومعلومات كثافة الذروة بشكل افتراضي. ويمكن تصدير قائمة الذروة إلى أطياف لاحقة ويمكن قراءتها من قبل برامج أخرى.

الآن مراقبة أطياف HSQC البروتين للتغيرات في ذروة الشدة أو الحركة في التحولات الكيميائية التي تشير إلى التفاعل مع جزيء آخر. إذا كان الجزيء التفاعل كبير، نتوقع انخفاضات في شدة الذروة جنبا إلى جنب مع اختفاء بعض القمم. استيراد قائمة الذروة إلى مجموعة البيانات التالية عن طريق النقر على علامة التبويب قمم وتحديد الاستيراد مع النقر بزر الماوس الأيمن في نافذة القمم.

تصور القمم عبر الطيف وإذا لزم الأمر، قم بتحويلها إلى مواقع جديدة. انقر على شدة إعادة تعيين لجدول كامل لتوليد قائمة الذروة للطيف الذي يتضمن كثافة. هذه القائمة الذروة سوف تحمل على معلومات الموقف من قائمة الذروة المخزنة.

قم بتصدير قوائم الذروة من مجموعات البيانات المختلفة إلى جدول بيانات أو برنامج رياضي آخر للتحليل عن طريق تحديد وظيفة التصدير. حساب التغير في شدة الذروة مع كثافة الذروة وظيفة في الطيف المعقدة، وكثافة الذروة في طيف البروتين لكل ذروة. يمكن تحويل القيم إلى تغيير النسبة المئوية عن طريق الضرب بنسبة 100.

لاحظ أن أحجام الذروة مفيدة أيضاً، على الرغم من أن قياس شدة الذروة أسهل بالنسبة للذرى التي تقع بالقرب من بعضها البعض، كما هو الحال عادة بالنسبة للبروتينات ذات الكثافة العالية من القمم الواسعة نسبياً. تم الحصول على N15HSQCs للنوع البري E-PRD، وكذلك متحولة R1914E، في وجود أو عدم وجود فيمرود. يُظهر طيف النوع البري E-PRD العدد المتوقع من القمم التي تم حلها بشكل جيد، مما يدل على بروتين مطوي بشكل صحيح.

في وجود فيمرود، يظهر الطيف توسيع خط واسع وأقصى اختفاء، المقابلة لربط بين E-PRD و VimRod. ويلاحظ تغيير يذكر بين طيف من R1914E متحولة من تلقاء نفسها وعلى إضافة فيمرود، مما يشير إلى عدم وجود ربط لهذا متحولة E-PRD. هنا تم مقارنة كثافة الذروة E-PRD في وجود وغياب VimRod ورسمها ككثافات الذروة النسبية للإشارة إلى مدى اتساع الذروة في مجمع E-PRD.

للتحقق من صحة وكمية الربط من VimRod وE-PRD، تم تنفيذ تحليل MST باستخدام His6-VimRod المسمى مع صبغة RED-tris-NTA الفلورية كهدف، وذلك باستخدام انخفاض تركيزات من ليغاند E-PRD. كانت البيانات مناسبة مع نموذج قياسي من ملزم ليغاند في موقع واحد وأعطت KD من 25.7 زائد أو ناقص 2.1 ميكرومولار. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن استخدام ظروف الاقتناء والمعالجة متطابقة.

سوف النضال بسبب الحصول على عينات من البروتين المسمى النظائر لجمع أطياف NMR. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج السرطان أو العدوى أو الأمراض العصبية لأنها تنطوي على تكوين تفاعلات البروتين التي تتعرض للخطر في المرض.