عزل جلوميرولي و في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي
January 18th, 2019
نقدم هنا بروتوكولا مورين في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي مع البيوتين. هذا البروتوكول يتضمن معلومات عن كيفية نتخلل الكلي الماوس وعزل glomeruli وأداء إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية من بروتين الفائدة.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الكلى حول دور الاتجار ببروتين سطح الخلية في البروتينات وليس مرض الكلى البروتيني. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يسهل دراسة الاتجار البروتين السطحي الخلية في- vivo وأنه يمكن تحليل أكثر من بروتين واحد لكل تجربة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الاتجار سطح الخلايا الكبيّة، يمكن أيضا أن تطبق على نظم الأعضاء الأخرى التي يتم perfused ويمكن الوصول إليها عن طريق تقنيات العزل.
تبدأ من خلال تأكيد عدم وجود استجابة لقرصة إصبع والتطهير الجانب البطني من الماوس تخدير مع 70٪ isopropyl. جعل قطع متوسط من خلال الجلد من الحوض إلى القص واستخدام ملاقط لإزالة الجلد من اللفافة البطنية. قطع الجلد على جانبي خط وسط البطن وجعل المتوسطة من خلال طبقة عضلات البطن من المثانة إلى xiphoid.
استخدام مقص ملقط لتقسيم العضلات إلى أربعة أرباع واستخدام اثنين من المشابك الجراحية لتأمين الربعين العلويين نحو عنق الحيوانات. وضع الحيوان تحت المجهر تشريح واستخدام مبادلة عقيمة لنقل جانبا الأجهزة الحشوية. باستخدام مقص غرامة، وقطع الرباط الكبدي.
باستخدام ملاقط الجراحية غرامة، ووضع خياطة واحدة حول الشريان المينارت الكبدي برانيال الشرايين الكلوية. وحول الشريان الأورطي، القريب من الشرايين الكلوية، في الغدة الكظرية. حرّر الشريان الأورطي من اللفة والدهون والأنسجة الأخرى.
ثم، المشبك في الوريد الكافا والشراية الأبهر في ذروة التشعب ووضع خياطة أخرى حول الشريان الأورطي من الشرايين الكلوية. استخدام ملاقط لتشد خياطة الأبهر القريبة، مما يخفف من تدفق الدم وقطع حفرة صغيرة نصف قطر الشريان الأورطي في الشريان الأورطي، وينعزل إلى الشرايين الكلوية. أدخل قسطرة 10 سنتيمترا تعلق على حقنة 10 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من الجليد البارد PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم في الشريان الأورطي.
وأصلح القسطرة بالأربطة المعدة ثم تبدأ في ضخ الكلى بمعدل تدفق مليلتر اثنين في الدقيقة. باستخدام مقص غرامة لقطع ثقب في الوريد الكلوي في الشرايين الكلوية وتضييق خياطة حول الشرايين الكبدية والميناتريانتي.
بعد أن تم تسليم كامل حجم برنامج تلفزيوني استبدال perfusate مع خمسة ملليلتر من الجليد البارد PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم تكملها 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر البيوتين لوضع العلامات السطحية. الاستمرار في ضخ الكلى بمعدل تدفق ميليليمترين في الدقيقة. عندما تم تسليم وحدة التخزين بأكملها، نعلق حقنة تحتوي على خمسة ملليلترات من الجليد البارد برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم تكملها 100 ملليمولار جليسين إلى القسطرة.
إخماد الكبيبات مع جميع المليلترات الخمسة من محلول الجليسين بمعدل تدفق مليلترين في الدقيقة. ثم اثقب الكلى بخمس ملليلترات من الثلج البارد PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم المكملة مع 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي لكل ملليلتر بمعدل تدفق ملليلتر في الدقيقة. وسوف الانصمام من الكبيبات مع الخرز المغناطيسي البني تكون مرئية على سطح الكلى.
عندما تم تسليم كل من الخرز إزالة كبسولة الكلى وحصاد الكلى في هيلوم. ضع الكلى في طبق ثقافة الخلايا 10 سم يحتوي على 15 ملليلتر من PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم. استخدام شفرة جديدة مزدوجة الحواف لقطع الكلى إلى أصغر القطع الممكنة.
نقل الأنسجة إلى أنبوب ملليلتر اثنين تحتوي على ملليلتر واحد من الكولاجيناز A لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، وخلط حل الأنسجة بلطف قبل وبعد الهضم مع تعديل 1000 ميكروليت ماص تلميح. في نهاية الحضانة ، قم بفرز الأنسجة المهضمة من خلال مصفاة خلايا 100 ميكرون. استخدام مكشطة الخلية والجليد البارد PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم لهرس الأنسجة المتبقية من خلال مصفاة الخلية.
جلب الحجم النهائي من تعليق الخلايا الكلوية واحدة تصل إلى 50 ملليلتر مع الجليد الطازجة الباردة PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم وجمع خلايا الكلى عن طريق الطرد المركزي. إزالة supernatant ثم إعادة تعليق بيليه مع أقل قليلا من 1.5 ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم في حين دوامة ونقل تعليق الكبيات في أنبوب جديد ملليلتر. لغسل الكبيبات، ضع الأنبوب في مغناطيس لتجميع الكبيات.
بعد دقيقة واحدة، استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لإزالة المابس. و أزيل الأنبوب من المغناطيس إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم إلى الأنسجة.
الميّزة الكبيميرولي أعلى ولون مرة واحدة ودوامة الخلايا. عودة أنبوب إلى المغناطيس وغسل كبيبرولي مرة أخرى كما أظهرت للتو. حتى وصلت نقاء عينة ما لا يقل عن 90٪ عن طريق ضوء تحليل المجهر في 40 إلى 100 X التكبير.
ثم جمع الخرز المغناطيسي تنقية glomeruli بواسطة الطرد المركزي. لتحقيق أكبر من نقاء 95٪، والكبيبيuli بحاجة إلى أن تغسل جيدا كما هو موضح. بيوتين perfusion يسهل وضع العلامات من الحلقات الشعرية في البيوتين ولكن لا تسيطر على الكلى الماوس perfused.
هطول الأمطار المناعية من جزء البيوتين من مقتطفات الكبيبية يكشف أن البروتينات عبر الmembrane الكبيبية nephrin وpodocalyxin هي مناعية مع البيوتين ولكن ليس مع جزء السيطرة. تلوين من الكسر المناعي مع streptavidin يؤكد كذلك وجود البيوتين يثن nephrin في الحيوانات التي تم غرسها في البيوتين ولكن لا السيطرة على الحيوانات التي غرست. إن بروتين البطانية الوعائية الوعائية كادهيرين التصاق داخل الخلايا وجزيء التصاق داخل الخلايا اثنين أيضاً مناعية داخل جزء البيوتين.
في المرحلة المبكرة من التهاب الكلية الكلى الكلي لوحظ انخفاض التعبير عن نيخر سطح الخلية في التهاب الكلية الكلوية مقارنة بالضوابط. في الواقع تحليل densitometic يظهر انخفاضا كبيرا من البيوتين اِثنت كلي في التهاب الكلية الكلى الكلى مقارنة مع وحدات التحكم. التحليل الكمي لمجموع نسبة الكلى إلى actin يكشف عن عدم وجود اختلافات كبيرة بين السيطرة وداء التهاب الكلية الكلى.
بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت كميات متساوية من podocytes في التهاب الكلية الكلوية والحيوانات التحكم. في أواخر التهاب الكلية الكلوية، تظهر الكلى السمية الكلية انتعاشاً في تعبير الكلى مع عدم وجود اختلافات كبيرة في كلية سطح الخلية مقاسة بين فئران الكلى التحكمية والسمية الكلوية الكلية والانخفاض الكلي الكلي في الكلى في الكلى. وعلاوة على ذلك، يتم تقليل أعداد podocyte بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر للحفاظ على حقن فقاعة خالية أثناء اتصالها من أجل تجنب انسداد الهواء من الكبيبات والعمل في ظل ظروف البرد الجليد مرة واحدة بدأت ضخ الكلى. بعد هذا الإجراء يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عزل رنا كبيبات الكريات والبروتين للإجابة على أسئلة إضافية حول تعبير البروتين أو التفاعلات في الكلى الصحية والمُرَضَة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لوضع علامة على بروتينات سطح الخلية الكبيبية في الفئران باستخدام البيوتين في الجسم الحي. توضح الخطوات اللازمة لغسل كلى الفئران، وعزل الكبيبات، وإجراء الترسيب المناعي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الكلى
- بيولوجيا الخلية
- تنقل البروتينات
الخلفية
- فهم تنقل بروتينات سطح الخلية أمر بالغ الأهمية في أبحاث أمراض الكلى.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنظمة الأعضاء المختلفة.
- تتيح تحليل عدة بروتينات في تجربة واحدة.
- توفّر الدراسات في الجسم الحي رؤى لا يمكن تحقيقها باستخدام الطرق المختبرية.
هدف الدراسة
- التحقيق في دور تنقل بروتينات سطح الخلية في أمراض الكلى.
- تطوير بروتوكول موثوق لدراسة البروتينات الكبيبية.
- تعزيز فهم الحالات الكلوية البروتينية وغير البروتينية.
الطرق المستخدمة
- غرسة كلى الفئران باستخدام البيوتين.
- عزل الكبيبات من الكلى.
- الترسيب المناعي الذاتي للبروتينات المستهدفة.
- تأكيد التخدير والتحضير الجراحي للفأر.
النتائج الرئيسية
- نجح البروتوكول في وضع علامة على بروتينات سطح الخلية الكبيبية.
- يمكن تحليل عدة بروتينات في وقت واحد.
- تم الحصول على رؤى حول آليات تنقل البروتينات.
- يمكن تكييف الطريقة لاستخدامها في أنظمة الأعضاء الأخرى.
الاستنتاجات
- يعتبر هذا البروتوكول أداة قيمة لأبحاث علم الكلى.
- يوفر إطارًا لدراسة تنقل البروتينات في الجسم الحي.
- يمكن للدراسات المستقبلية توسيع تطبيقها على أمراض أخرى.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Studying glomerular cell surface protein trafficking in vivo provides mechanistic insights into kidney disease pathogenesis, supporting target validation in nephrology. This method enables semi-quantitative analysis of surface protein abundance under physiologic and pathophysiologic conditions, enhancing predictive confidence in preclinical models. It facilitates biomarker discovery and pathway clarification relevant to proteinuric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking cell surface protein dynamics in intact glomeruli.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct observation of nephrin and podocalyxin trafficking in disease models.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts for assessing target engagement and pathway modulation in vivo.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified glomerular fractions suitable for downstream immunoprecipitation and protein interaction analysis.
- Reproducibility: Standardized perfusion and magnetic bead isolation yield consistent glomerular preparations across experiments.
- Multiplex Capability: Allows simultaneous analysis of multiple surface proteins per experiment, increasing screening efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Captures dynamic changes in nephrin expression during early and late phases of nephrotoxic nephritis.
- Translational Continuity: Links in vivo protein trafficking observations to podocyte loss and disease progression.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein changes reflect surface trafficking versus total expression shifts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation by providing functional, in vivo data on glomerular protein behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on protein trafficking mechanisms in kidney disease models.
- Screening: Delivers quantitative, biotin-dependent immunoprecipitation outputs for comparing protein surface exposure.
- Analytics: Enables semi-quantitation of glomerular cell surface abundance via streptavidin-based detection.
- Translational Research: Connects surface protein dynamics to histologic and functional outcomes in nephritis models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other perfused organ systems, supporting cross-indication target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing surface trafficking from total protein expression changes.
- Operational Value: Standardized perfusion and isolation workflows improve reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing target accessibility and modulation in physiologic contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on in vivo surface protein behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, vascular perfusion, and tissue dissection under sterile conditions.
- Dependent on perfusion equipment, magnetic separation tools, and immunoprecipitation reagents.
- Necessitates standardization of biotin perfusion timing, flow rate, and quenching steps for consistent labeling.
- Adaptation to other organ systems requires validation of accessibility and perfusion efficiency.
- Practical limitations include tissue fragility during digestion and the need for high-purity glomerular isolation (>95%) for reliable downstream analysis.
