قطب الصغير-أجار ملح جسر لتحليل معدل دوران بروتون بروتينات الغشاء المؤتلف

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فحص بروتينات الأغشية مثل الناقلين والقنوات. المعلومات حول فقدان معدل دوران الركيزة مقارنة نشاط البروتين وخصوصية والظروف الفسيولوجية والمرضية المختلفة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقلل من احتمال تغير التحول والظروف العازلة الحرة للكلوريد.

ويزيد بشكل كبير من دقة تحديد معدل الدوران بسبب قياسات محتملة أكثر دقة للغشاء. جمع العناصر للخطوات قبضة. وتشمل هذه اثنين من نصائح ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة، شفرة حادة والفرجار انزلاق.

لأقطاب لديها الأسلاك الفضية، ورقة الرمل وثلاثة محلول كلوريد البوتاسيوم المولر في متناول اليد. وبالإضافة إلى ذلك الإيثانول والماء لتنظيف وإمدادات الطاقة DC. المضي قدما من خلال العمل مع اثنين من نصائح الصغيرة ماصة.

ابدأ بالتلميح الذي يحتوي على المخزن المؤقت. ضع الطرف الثاني بجوار الأول. نقل الطرف الثاني، لذلك، عندما إدراجه سوف تمتد على الأقل خمسة ملليمترات جزء ضيق في الجزء الأول.

وضع علامة على الموضع الذي سيتم إرفاق أول مخزن مؤقت يحتوي على تلميح. ثم استخدام الفرجر لقياس طول القطب جسر الملح الصغيرة أجار. استخدام شفرة لقطع الطرف إلى الطول المناسب.

تنظيف السطح مع قطع الإيثانول تليها المياه. بعد ذلك، الحصول على طول ما يقرب من ثمانية سنتيمترات من الأسلاك الفضية للالكترود. تنظيف السلك على مناديل مع الإيثانول تليها المياه.

بعد التنظيف، استخدم ورق الرمل لتنعيم السطح على طول سنتيمتر واحد في نهاية واحدة. هذا السلك مع نهايته ممهدة على استعداد لتكون المغلفة كهربائيا كيميائيا. وضع نهاية ممهدة في محلول كلوريد البوتاسيوم مع الطرف الآخر متصلة إمدادات الطاقة DC للطلاء.

عندما المغلفة، فصل القطب وتنظيفه بالماء. بعد تجفيفه، وتحديد الطول الذي يسمح لها لاختراق طرف الشعرية الصغيرة أعمق قدر الإمكان. قطع القطب الكهربائي من الجانب غير المصقول إلى الطول المناسب.

الآن، انتقل إلى إعداد محلول الملح مع agarose. في قارورة تحتوي على الماء تذوب كلوريد البوتاسيوم واستخدام الستيرر المغناطيسي للمساعدة في خلط. بعد إزالة المُحرك أضف أغاروز إلى القارورة.

خذ القارورة إلى الميكروويف وتسخينها لإذابة الأذانوز عند حوالي 100 درجة مئوية. أخرجه للتحقق بصريا من أن agarose يذوب تماما. مرة واحدة يتم حل أجاروز ماصة 10 ميكرولترات في الشعيرات الدموية الصغيرة ببطء لتجنب فقاعات الهواء.

من المهم أن الماصة بعناية محلول ملح أجار في طرف الشعيرات الدموية الصغيرة ، خاصة عند تركيزات agar العالية. إذا لم يتم ذلك بشكل صحيح يتم إنتاج فقاعات الهواء بسهولة في الطرف وكتلة التدفق الكهربائي. بعد إزالة طرف من ماصة دفع القطب في ذلك.

تأكد من أن القطب يخترق محلول الملح. عندما يكون القطب في درجة حرارة الغرفة سده في القطب المرجعي في مكبر للصوت. دعم القطب المرجعي بحيث يمكن خفضها في حاوية بلاستيكية مع واحد ملليلتر من العازلة.

بعد ذلك، تراجع القطب جسر الملح في الحل. تطبيق الجهد والتحقق من أن هناك استجابة الحالية قبل المتابعة. إذا نجح الاختبار، افصل الأقطاب الكهربية.

إذا لزم الأمر، قم بتخزين قطب جسر الملح عن طريق غمسه في محلول كلوريد البوتاسيوم المولاري الثلاثة. بعد ذلك، قم بإعداد المخزن المؤقت الذي يحتوي على طرف بلاستيكي. خذ طرف الشعرية الصغيرة وتحديد نقطة اثنين من سنتيمترين من الجزء الضيق.

استخدام سلك التدفئة لثني أنبوب 90 درجة في هذا الموقف. بسكين حاد قطع الأنبوب خمسة ملليمترات من عازمة. تنظيف المنطقة التي تم قطعها بالإيثانول تليها المياه.

قبل المضي قدما، واستخدام المجهر الخفيفة مع مقياس لقياس قطر الثقب في الطرف. المقبل، نقل ماصة لتكون بالقرب من حاوية من المذيبات وآخر من العازلة. الماصات ثلاثة ميكروليترس من المذيبات داخل وخارج الطرف.

المقبل، وملء غيض القياس مع ثلاثة ميكرولترات من العازلة. الآن، إسترِدْ الجسر الملحِ مِنْ محلول كلوريد البوتاسيومِ. قم بتوصيل طرف القياس بالمخزن المؤقت على قطب جسر الملح.

قم بتوصيل قطب الملح وكهربة الأقطاب المرجعية بمكبر للصوت. عند هذه النقطة، تعليق القطب جسر الملح في حل العازلة مع القطب المرجعي. يوجد تمثيل للتكوين الخاص بالتجربة في هذا التخطيطي.

خلال التجربة، سوف تتشكل الغشاء في نهاية العازلة التي تحتوي على ماصة. جمع البيانات للعثور على قدرة الغشاء. القيام بذلك عن طريق تطبيق إشارة الجهد الثلاثي بالتناوب لإنشاء استجابة مستطيلة بالتناوب الحالية.

بعد ذلك ، العثور على تسيير والجهد في صفر الحالية. أتمتة تطبيق منحدر الجهد تتراوح بين ناقص 50 إلى 50 millivolts وتسجيل التيار. احتواء دالة خطية للبيانات.

المنحدر هو الاتّار، تقاطع x هو الجهد عند مستوى الصفر. عند الانتهاء من إزالة طرف القياس من جسر الملح. املأ طرف قياس جديد بالمخزن المؤقت، وقم بضبطه مع قيمة pH مختلفة لإعداد تدرج بروتوني عبر الغشاء.

إعادة إنشاء مجموعة تجريبية مع طرف قياس جديدة وأقطاب من أجل تكرار القياسات. وهنا تمثل التسجيلات التيار الجهد في وجود التدرج درجة الحرارة. و، في غياب التدرج في مستوى الـ (PH).

تمثل الخطوط تناسب خطي للبيانات. يتم توقع التحول في نقطة تقاطع المحور س لقيم درجة PH مختلفة بواسطة Nernst المعادلة. وتمثل هذه البيانات التحول في إمكانية الغشاء في الوقت المناسب لأقطاب كلوريد الفضة القياسية باللون الأبيض، وكهربة جسر الملح الصغير أجار باللون الأسود.

وكان قطب جسر الملح أجار أكثر استقرارا مع تحول الحد الأقصى من أقل من خمسة ملليفولت على مدى 300 ثانية من القياس. في هذه المؤامرة من التحول المحتمل كدالة للتدرج pH وينظر إلى اثنين من الأقطاب تتصرف بشكل مختلف بشكل كبير كما يزيد التدرج pH. ويمكن العثور على معدل دوران البروتون ومقارنتها لأنواع القطبين.

هنا أرقام دوران البروتون المحددة للبروتين الميتوكوندريا فك البروتين واحد UCP1 تقاس بواسطة القطب جسر الملح مقارنة القطب القياسي. وهناك أيضا بيانات عن UCP3 أعدت بالمثل. معدلات تبدو أكثر دقة مع القطب جسر الملح أجار.

أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن تتأكد من أن القطب يخترق محلول الملح أجار. يجب أن جسر الملح أيضا تراجع في حل العازلة. وأخيرا، تأكد من أن محلول الملح أجار لا يحتوي على فقاعات الهواء.