Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Dongxiao Li; Yundu Li; Yunyun Tian; Zuoshang Xu; Yansu Guo

doi:10.3791/58565

حقن Intrathecal المباشر للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف في الفئران الكبار

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

حقن Intrathecal المباشر للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف في الفئران الكبار

Full Text

39,241 Views

08:17 min

February 15, 2019

DOI: 10.3791/58565-v

Dongxiao Li*¹, Yundu Li*², Yunyun Tian¹, Zuoshang Xu³, Yansu Guo^1,4

¹Department of Neurology,Second Hospital of Hebei Medical University, ²No.2 Middle School of Shijiazhuang, ³Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,University of Massachusetts Medical School, ⁴Key Laboratory of Hebei Neurology

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a direct intrathecal injection technique utilizing 1% lidocaine hydrochloride in a viral solution to enhance the delivery of adeno-associated virus to small animals, specifically targeting central nervous system diseases such as ALS. It establishes a scoring system that correlates the degree of transient weakness induced by lidocaine with transduction efficiency.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Gene Therapy
Intrathecal Delivery

Background

Adeno-associated viruses are commonly used for gene delivery to the nervous system.
Methods for effective delivery in small animal models are critical for advancing therapeutic strategies.
Lidocaine has been employed for its transient paralysis effects, which indicate successful intrathecal injections.
Optimizing delivery methods can improve outcomes in experimental treatment of central nervous system diseases.

Purpose of Study

To demonstrate a reliable technique for intrathecal delivery of viral solutions in awake small animals.
To create a predictive scoring system for evaluating transduction efficiency.
To improve the understanding of the effectiveness of adeno-associated virus delivery mechanisms.

Methods Used

The technique involves direct intrathecal injection using a 27 gauge needle attached to a 25 microliter Hamilton syringe.
Small animals, specifically mice aged 30 to 70 days, are used as the biological model.
Important procedural steps include preparing the syringe, aligning the needle for injection, and monitoring transient weakness as an indicator of success.
Post-injection, mice undergo surgical procedures to extract brain and spinal cord tissues for analysis.

Main Results

The study finds a robust correlation between the magnitude of transient limb weakness and the extent of spinal cord transduction.
Significant eGFP immunostaining results indicate varying levels of transduction across different nervous system regions based on the weakness scores.
Key structures showing strong transduction include the olfactory bulb, hippocampus, and anterior horns of the spinal cord.

Conclusions

This study establishes a new method for effective adeno-associated virus delivery to the central nervous system in small animals.
The transient weakness score serves as a reliable measure of injection efficacy.
Findings enhance the understanding of gene therapy approaches and their optimization in treating neurological diseases.

Frequently Asked Questions

What is the advantage of using lidocaine in the injection?

Lidocaine induces transient paralysis, providing a clear visual indicator for the success of the intrathecal injection.

How is the injection performed on the animal?

The animal is positioned prone, and the intervertebral space is palpated to guide the needle insertion for intrathecal delivery.

What types of outcomes can be measured from this method?

Outcomes include the extent of viral transduction, as indicated by eGFP immunostaining and assessment of transient limb weakness.

How can this method be adapted for other studies?

The technique may be modified for different viral vectors or other small animal models, facilitating broader applications in gene therapy research.

What are some limitations of this technique?

Successful implementation requires sufficient practice to minimize complications and ensure consistent delivery across trials.

What biological regions were effectively transduced?

Key areas include the olfactory bulb, hippocampus, and spinal cord, with transduction intensity correlating with the weakness score of the mice.

Why is spinal cord tissue extraction important?

Extracting and analyzing spinal cord tissue helps evaluate the efficacy of the viral vector and provides insight into therapeutic impacts on the nervous system.

وهنا يقدم تقنية حقن intrathecal مباشرة باستخدام 1% ليدوكائين هيدروكلوريد في حل فيروسية لضمان تسليم الفيروسات الكفاءة المرتبطة بالغدد للحيوانات الصغيرة، وإنشاء نظام لتسجيل النقاط للتنبؤ بكفاءة توصيل في وسط الجهاز العصبي وفقا لدرجة ضعف عابرة الناجمة عن ليدوكائين.

هذه الطريقة تسهل التسليم الفعال داخل منطقة المحيط الفوقا للعدوى الفيروسية المرتبطة adeno في الحيوانات الصغيرة مستيقظا للعلاج التجريبية لأمراض الجهاز العصبي المركزي مثل ALS. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن الحل الفيروسي يشمل 1٪ ليدوكاين هيدروكلوريد الذي يسبب شلل عابر بعد الحقن الناجح. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر مؤشرا بصريا للحكم على نجاح الوضع الآلي داخلا، والممارسة الكافية أمر ضروري لتحسين معدل نجاح التسليم.

قبل البدء في الإجراء، قم بتوصيل إبرة قياس 27 بحقنة هاملتون 25 ميكروليتر ومحاذاة طرف الإبرة المشططوف مع المقياس الحجمي على الحقنة. ثم تحميل بعناية 8 ميكرولترات من 4 × 10 إلى 10 نسخ الجينوم من حل الفيروس في الحقنة، مع الحرص على تجنب فقاعات. بعد ذلك، ضع ماوسًا مستيقظًا من 30 إلى 70 يومًا من العمر 12 إلى 30 جرامًا على قطعة سرير في موضعه المعرض في غطاء للسلامة الحيوية وغط الجزء العلوي من الجسم بشاش معقمة لتهدئة الماوس وتجنب التعرض للعض.

قبضة بحزم الماوس على حزام الحوض مع الإبهام على جانب واحد والسبابة والاصبع الأوسط على الجانب الآخر حفظ الجلد بين حزام الحوض الثنائي مشدود مع الإبهام والسبابة. ثم حلق الفراء بين احزمة الحوض الثنائية وتعقيم الجلد المكشوف مع فرك اليود القائم والإيثانول 70٪. للتسليم المباشر داخل المنطقة من حل الفيروس المرتبط بأدينو، جس الفضاء بين الفقرات على طول خط الوسط بين مربط الحوض الثنائي واستخدم ظفرًا لتخريب المسافة البادئة في الجلد للإشارة إلى المساحة الفقرية L5 إلى L6.

تدوير قاعدة الذيل قليلا وبلطف للكشف عن خط الوسط من العمود الفقري وضبط شطبة من الإبرة نحو رأس الحيوان. مع الماوس ثابتة بحزم في الموقف، محاذاة الإبرة على طول خط الوسط من العمود الفقري وإدراج إبرة بلطف وعموديا في وسط المسافة البادئة حفظ حقنة في مستوى القوس المركزي. عندما يأتي الإبرة في اتصال مع العظام، وانخفاض ببطء زاوية إلى ما يقرب من 30 درجة وزلة الإبرة في الفضاء بين الفقرات.

نفض الغبار ذيل المفاجئ هو علامة على دخول ناجحة في الفضاء داخل الأمعاء. عندما تدخل الإبرة إلى الفضاء الفقري، سوف تشعر التلميح بتضييق الخناق عليها. حقن حل ناقلات، والحفاظ على إبرة داخل الفضاء داخل الأمعاء لمدة دقيقة واحدة.

ثم سحب ببطء الإبرة مع دوران للحد من التسرب. على الفور تسجيل الضعف العابر لأطراف الماوس لتقييم جودة الحقن والعودة إلى قفص الماوس للتعافي من الشلل. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، قم بإصلاح أطراف الماوس المحقون ورأسه في موضع العرّضة على غطاء صندوق الرغوة واستخدم المقص لتجريد الجلد من الرأس إلى العجز.

قص الجمجمة بين العينين، وقطع على طول خط الوسط من الجمجمة والخط الأفقي فوق المخيخ وفتح الجمجمة على كل جانب. استخدم ملاقط لإزالة العظم القذالي واستخدام مقص العيون لفتح القناة الشوكية ثنائياً. قطع الأضلاع على كلا الجانبين وإزالة بعناية الجزء العلوي من الفقرات.

استخدم ملاقط منحنية لرفع الدماغ وقطع أعصاب قاعدة الجمجمة. ثم استخراج بعناية الدماغ كله والحبل الشوكي وإصلاح الأنسجة في 4٪ شبهformaldehyde لمدة 24 ساعة. في نهاية فترة التثبيت، cryoprotect الدماغ وعنق العنق والحبل الشوكي القطني في محلول السكروز 30٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تليها تضمين في مركب درجة حرارة القطع الأمثل قبل المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل.

ثم استخدم المبردات للحصول على 25 ميكرومتر سميكة أجزاء من كل نسيج، وتخزين المقاطع المجمدة في 0.01 PBS الضرس في 4 درجات مئوية كما يتم الحصول عليها. للتحليل المناعي الكيميائي للأنسجة، قبل معالجة الأجزاء العائمة الحرة مع بيروكسيد الهيدروجين 1٪لمدة 10 دقائق تليها غسل 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني. احتضان المقبل العينات في محلول منع تحتوي على 5٪ مصل و 0.3٪ المنظفات غير الأيونية في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة تليها وضع العلامات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة من الفائدة.

في اليوم التالي، وغسل المقاطع مع 3 10 غسل دقيقة في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى توين واحتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة الحيوية المناسبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة بعد الغسيل الماضي. في نهاية الحضانة، وغسل أقسام 3 مرات في PBST جديدة كما أظهرت للتو واحتضان العينات مع مجمع peroxidase البيوتين اللانهاية لمدة 40 دقيقة تليها تلطيخ مع عامل chromogenic المناسبة. قم بتركيب المقاطع المسماة على شرائح المجهر الزجاجي ونقع الشرائح في الإيثانول اللامائية لمدة 5 دقائق بمجرد أن تجفف الأجزاء المثبتة بالكامل.

المقبل نقع الشرائح في إكسيلين لمدة 10 دقائق وختم لهم مع وسيلة مناسبة تصاعد. ثم صورة الشرائح مع مجهر خفيف مجهزة جهاز الشحن مقرونة في 100، 200، و 400 مرة التكبير. eGFP المناعة من عنق الرحم والأقسام النسيج النخاعي القطني يكشف عن القليل أو لا تحويل في الحبل الشوكي القطني من الفئران مع درجة ضعف 0، وتعزيز قليلا تحويل في الفئران مع درجة ضعف 1، وtransductions قوية وواسعة النطاق في الفئران مع درجة ضعف 4 أو 5.

يشير القياس الكمي لشدة تلطيخ GFP لأطراف أنسجة الحبل الشوكي من الفئران التي تعرض درجات مختلفة من ضعف الأطراف العابرة إلى أن شدة الضعف بعد حقن محلول الفيروس ترتبط ارتباطًا وثيقًا بمدى نقل الحبل الشوكي. في الدماغ، يتم الكشف عن إشارات eGFP قوية في لمبة الشم، القشرة الجبهي الظهرية، الجيروسكوبية، وcyrus، ومنطقة CA3 من قرن آمون، قشرة المخ، والمناطق الهامشية من الدماغ، بما في ذلك نواة الوجه، الضفيرة المشيمية، والخلايا الظهارية. الخلايا العصبية الحركية في قرون الأمامية هي أيضا نقل بقوة في مستويات مختلفة من الحبل الشوكي.

وعلاوة على ذلك، في القشرة، يتم الكشف عن الخلايا العصبية الإيجابية GFP بما في ذلك الخلايا الهرمية، فضلا عن أنواع الخلايا الدبقية المختلفة بما في ذلك microglia، استروتكس، و oligodendrocytes. هذه التقنية تمكن الباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف الآثار العلاجية للتسليم المباشر داخل داخل الحيوانات الصغيرة مستيقظا على أمراض الجهاز العصبي المركزي.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos