أسلوب المستندة إلى الأشعة المقطعية الصغرى لتميز الآفات وتحديد مواقع الأقطاب في أدمغة الحيوانات الصغيرة
November 8th, 2018
توضح هذه المقالة طريقة واضحة لإعداد أدمغة الحيوانات الصغيرة لتصوير الأشعة المقطعية الصغرى، في الآفات التي يمكن قياسها كمياً واقطاب الموقع بدقة عالية في سياق الدماغ كله.
يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب من خلال توفير طريقة أبسط وأقل عرضة للخطأ وأكثر كميًا للتحقق من الآفات وتحديد مواقع القطب الكهربائي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتحقق من الآفات ومواقع القطب في الدماغ بأكمله دون الحاجة إلى القطاعات. المنتج النهائي هو حجم 3D الرقمية من الدماغ وأدمغة متعددة يمكن معالجتها بالتوازي.
على الرغم من أن هذه الطريقة سوف تظهر في الفئران، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على الكائنات الحية الأخرى، مثل الفئران وحمار وحشي. عموما، سوف الأفراد جديدة لهذه الطريقة النضال لأن بعض الخطوات تتطلب عناية خاصة لضمان أفضل النتائج. للبدء، وضع الدماغ المستخرج في محلول الوفرة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
تخزين العينة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام مع اهتزاز لطيف في أربع درجات مئوية. تأكد من أن يتم تخفيف أوسميوم في الماء وليس عازلة. وذلك لأن الماء سيكون بمثابة المنظفات خفيفة، والسماح للosmium لاختراق عمق الأنسجة.
إعداد 50 ملليلتر من 2٪ أوسميوم تتروكسيد في الماء المقطر المزدوج. ثم ضع الدماغ في أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر وأضف محلول أوزميوم تتروكسيد. أغلق الأنبوب وختمه بفلم البارافين لمنع التسرب.
تخزين أنبوب مختومة في أربع درجات مئوية مع اهتزاز لطيف لمدة أسبوعين. تأكد من وضع الأنبوب أفقياً. الدماغ سميك جدا وطرق طويلة للسفر عن طريق الانتشار.
وضع أنبوب أفقيا سوف تسمح osmium للسفر أعمق في الأنسجة. بعد العينة يحضن لمدة أسبوعين، وغسلها بالماء المقطر مزدوجة خمس مرات لإزالة جميع التيتروكسي أوزميوم غير منضم من العينة. بعد ذلك، قم بغسل العينة بالماء المقطر المزدوج لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
استبدل الماء المقطر المزدوج بأربعة تمييعات من الإيثانول لتجفيف العينة. لبدء عملية تسلل الراتنج، نقل العينة من خلال ثلاثة الأسيتون وثلاثة تخفيفات راتنج الأسيتون، ثم تزج العينة في 100٪ الراتنج في درجة حرارة الغرفة لمواصلة عملية التسلل. بعد ذلك، نقل العينة إلى قالب المتاح.
ضخ العينة مع 100٪ راتنج الطازجة لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. Degas العينة في فراغ الفرن لمدة 15 دقيقة في 45 درجة مئوية. ثم علاج العينة في الفرن لمدة 48 ساعة في 60 درجة مئوية.
وأخيرا، عندما انتهت العينة من العلاج، قشر قبالة القالب المتاح ومسحه مع آلة الأشعة المقطعية الدقيقة. في القطاعات التقليدية ، يجب أن يكون اتجاه الدماغ محددًا مسبقًا. باستخدام هذه الطريقة الدقيقة CT، يمكن التلاعب في حجم الرقمية من الدماغ عينة في ثلاثة أبعاد وشرائح تقريبا في أي اتجاه.
يؤكد المسح المجهري الإلكتروني لدماغ الفئران المعد أن الأنسجة لم تتضرر بشكل كبير لأغراض التصوير المقطعي المجهري. كما تم إعداد دماغ حمار وحشي وفحصه ضوئيًا وفقًا لهذا البروتوكول لاختبار فائدة هذه الطريقة على أدمغة الحيوانات الصغيرة الأخرى. يمكن استخدام هذه التقنية للعثور على الآفات السطحية في الدماغ ، وكذلك الآفات في عمق الدماغ.
ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على موقع tetrodes واحد في الموقع، والآفات الكهالكية، ومسارات القطب، صفائف tetrode في الموقع، ومسبار السيليكون في الموقع. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن تسمح للدماغ بالاحتضان لفترة طويلة بما فيه الكفاية ومع ما يكفي من الانفعالات. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل optogenetics والتصوير الفوتون من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول الدور الذي تلعبه مناطق الدماغ المختلفة في سلوكيات مختلفة.
هذه التقنية يمكن أن تسمح للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف أفضل العلاقات بين الهيكل والوظائف بين الدماغ والسلوك في الفئران والفئران والطيور المغردة وغيرها من الحيوانات الصغيرة. لا تنسى أن العمل مع osmium يمكن أن تكون خطرة للغاية والاحتياطات، مثل ارتداء القفازات والعمل في غطاء محرك السيارة فراغ ينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة لتحضير أدمغة الحيوانات الصغيرة، وخاصة أدمغة الفئران، لتصوير التصوير المقطعي المحوسب المصغر. تهدف التقنية إلى تحديد الآفات وتحديد موقع الأقطاب الكهربائية بدقة دون الحاجة إلى التقسيم، مما ينتج حجمًا رقميًا شاملًا ثلاثي الأبعاد للدماغ.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تقنيات التصوير
- تحليل الآفات
الخلفية
- يسمح تصوير التصوير المقطعي المحوسب المصغر بتحليل هياكل الدماغ غير المدمر.
- يمكن أن تكون طرق التقسيم التقليدية عرضة للأخطاء وتحد من مرونة التوجيه.
- تعزز هذه الطريقة من القدرة على تحليل الآفات ووضع الأقطاب الكهربائية.
- قابلة للتطبيق على حيوانات صغيرة مختلفة مثل الفئران وزرزور الزنابق.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة تحضير مبسطة وأقل عرضة للأخطاء للتصوير المقطعي المحوسب المصغر.
- توفير تحديد دقيق لموقع الآفات والأقطاب الكهربائية.
- تسهيل التلاعب ثلاثي الأبعاد لعينات الدماغ لتحسين التحليل.
الطرق المستخدمة
- المنصة الرئيسية المستخدمة هي تصوير التصوير المقطعي المحوسب المصغر لعينات الدماغ المحضرة.
- النموذج البيولوجي الرئيسي هو دماغ الفأر، لكن الطريقة قابلة للتكيف مع حيوانات صغيرة أخرى.
- تتضمن الطريقة فترات حضانة محددة واستخدام تتراوكسيد الأوسميوم لتحضير الأنسجة.
- تشمل الخطوات الحرجة وضع الأنبوب أفقيًا وخطوات غسل متعددة لضمان تغلغل الأوسميوم.
- تشمل التحضير النهائي علاج الراتنج والمسح الضوئي باستخدام آلة التصوير المقطعي المحوسب المصغر.
النتائج الرئيسية
- تسمح هذه الطريقة برؤية كل من الآفات السطحية والعميقة في الدماغ.
- تمكن من تحديد دقيق لمسارات الأقطاب الكهربائية والآفات مع الحفاظ على سلامة الأنسجة.
- تظهر العينات المسحونة أن تلف الأنسجة ضئيل، مما يؤكد قابلية التقنية للاستخدام.
- يمكن أن يدعم الإجراء تجارب إضافية مثل التصوير البصري الوراثي والتصوير ثنائي الفوتون.
الخلاصات
- توضح هذه الدراسة طريقة فعالة لتحضير أدمغة الحيوانات للتحليل التفصيلي باستخدام التصوير المقطعي المحوسب المصغر.
- تمكن التقنية الباحثين من استكشاف سلوك الخلايا العصبية والعلاقات الهيكلية دون الإضرار بالعينات.
- بشكل عام، تعزز القدرات البحثية في علم الأعصاب في فهم ميكانيكا الدماغ.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate lesion characterization and electrode localization are critical for validating mechanistic hypotheses in neuroscience-driven drug discovery. This micro-CT-based workflow enables high-resolution, quantitative mapping of brain interventions, reducing manual error and supporting reproducible, cross-study comparisons. The approach enhances predictive confidence at the target validation and preclinical model inflection points, directly impacting translational continuity and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of lesion placement and electrode localization for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing 3D anatomical context for intervention sites.
- Facilitates quantitative comparison of experimental manipulations across studies and models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain models for downstream functional assays and behavioral studies.
- Standardizes lesion and electrode mapping, improving reproducibility and assay reliability.
- Generates digital volumes suitable for automated or manual segmentation and analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns anatomical intervention data with behavioral and functional outcomes in disease-relevant systems.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-modal data integration.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This micro-CT method integrates at the interface of discovery biology and preclinical model validation, bridging anatomical verification with functional and behavioral readouts.
- Discovery Biology: Provides quantitative, 3D verification of experimental manipulations for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, high-resolution anatomical data to support assay readiness and cross-study standardization.
- Analytics: Enables digital measurement and comparison of lesion volumes and electrode positions across conditions.
- Translational Research: Supports alignment of anatomical and functional data for disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, digital workflow adaptable to multiple small animal models and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation studies.
- Operational Value: Streamlines verification processes, enabling parallel sample processing and digital archiving.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by standardizing anatomical validation across programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative anatomical data for model selection and advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue preparation, micro-CT imaging, and digital volume analysis.
- Demands access to micro-CT instrumentation and compatible analysis software (free or proprietary).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample handling and imaging protocols.
- Adaptable to various small animal models with protocol adjustments for tissue size and composition.
- Safety precautions are essential due to hazardous reagents such as osmium tetroxide.
