كيفية تحديد جزء صغير البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتيد بكميات كبيرة وفي الخلايا الحية
يناير 7, 2019
نقدم هنا، بروتوكول ينطوي على فوتواكتيفاتابل طيفيا متميزة إلى جانب وراثيا والبروتينات الفلورية. تسمح هذه التركيبات بروتين فلوري التحديد الكمي للكسر FP السلطة الفلسطينية هو فوتواكتيفاتيد أن تكون نيون، أي كفاءة فوتواكتيفيشن. البروتوكول يكشف عن أن أوضاع مختلفة من فوتواكتيفيشن تحقق الكفاءة فوتواكتيفيشن مختلفة.
نقدم هنا بروتوكول يتضمن الاقتران جينياً بشكل طيفي متميز للصور القابلة للتفعين والبروتينات الفلورية. تسمح هذه المساطر الداخلية بالكمية من جزء PAFP الذي يتم تنشيط الصورة لتكون الفلورسنت. حتى الآن، لم تكن هناك طريقة متاحة لتحديد كمي في الجزء الأكبر في خلايا الحياة كم من PAFP أعرب عن الصورة تنشيطها إلى الفلور. وتجسد الكمية المعروضة لكفاءة تنشيط الصور PA-GFP و PA Cherry في الخلايا الحية ولكنها من حيث المبدأ قابلة للتطبيق على نطاق واسع ويمكن استخدامها لأي بروتين فلوري قابل للتنشيط في ظل أي حالة تجريبية. كلما كان العمل مع البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا، فإن المبلغ المطلق من البروتينات التي أعرب عنها يختلف من خلية إلى خلية وأنه غير معروف. لتوحيد التعبير بين الخلايا، نقدم حكام داخليين من البروتينات الفلورية المتميزة من الناحية الجينية. عن طريق اقتران المعلومات الوراثية من البروتين الفلورسنت القابلة للتفعيل بالصور إلى متميزة طيفيا دائما على المساطر الداخلية البروتين الفلورية التي سيتم إنشاؤها لا يزال يتم التعبير عن كمية إجمالية غير معروفة ولكن في كمية نسبية ثابتة معروفة من واحد إلى واحد. لبدء بناء البلازميدات كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. أيضا، والثقافة في خط الخلية القياسية في وجهة نظرها المتوسطة باستخدام النسخة الحمراء الفينول. عندما تكون على استعداد لبدء التجربة، حصاد الخلايا باستخدام التربسين دون أحمر الفينول للحد من الفلوركنس الخلفية. بعد الحصاد، تعبئة ماصة 2 مل مع تعليق الخلية من ثقافة الخلية التقاء نمت في قارورة ثقافة خلية T 12.5. إضافة قطرة واحدة في كل غرفة من ثمانية قطعة زجاج الغرفة الشريحة. احتضان الشريحة تحت شروط ثقافة الخلية القياسية لمدة 24 ساعة. نقل الخلايا التالية باستخدام الكواشف التجارية التالية بروتوكول الموزعين. Transfect الخلايا مع GFP الكرز، PA-GFP الكرز وGFPPA الكرز الكيميرا. ثم إعادة الخلايا إلى الحاضنة للسماح للتعبير البروتين، للطي، والنضج. بعد ما مجموعه 20 ساعة بعد النقل، ونقل الخلايا إلى مرحلة مجهر فلورسنت confocal مجهزة غرفة بيئية مرطبة وساخنة قبل warmed إلى 37
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً يستخدم بروتينات فلورية ومستحثة ضوئياً متميزة طيفياً ومقترنة جينياً. وتسمح هذه الهجائن بقياس كفاءة الاستحثاث الضوئي لجزء PA-FP الذي يصبح فلورياً، مما يكشف أن أنماط الاستحثاث الضوئي المختلفة تعطي كفاءات متفاوتة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تقنية البروتينات الفلورية
- تقنيات التنشيط الضوئي
الخلفية العلمية
- تعد البروتينات الفلورية أدوات أساسية في الأبحاث البيولوجية.
- تتيح البروتينات الفلورية القابلة للتنشيط ضوئيًا التحكم المكاني والزماني في الفلورة.
- يعتبر فهم كفاءة التنشيط الضوئي أمرًا بالغ الأهمية لضمان دقة النتائج التجريبية.
- يمكن أن تؤثر طرق التنشيط المختلفة على أداء هذه البروتينات.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لتقييم كفاءة التنشيط الضوئي.
- مقارنة تأثيرات أنماط التنشيط الضوئي المختلفة.
- تعزيز فائدة البروتينات الفلورية الهجينة في الأبحاث.
الطرق المستخدمة
- الاقتران الجيني للبروتينات القابلة للتنشيط الضوئي والبروتينات الفلورية.
- تقدير كمية الجزء المنشط ضوئيًا.
- مقارنة تقنيات التنشيط الضوئي المختلفة.
- تحليل كفاءات التنشيط الضوئي.
النتائج الرئيسية
- أدت الأنماط المختلفة للتنشيط الضوئي إلى كفاءات متفاوتة.
- نجح البروتوكول في قياس كفاءة التنشيط الضوئي كمياً.
- أظهرت خيمرات البروتين الفلوري إمكانات كبيرة للتطبيقات البحثية.
- يمكن للرؤى المكتسبة أن تفيد الدراسات المستقبلية التي تستخدم البروتينات القابلة للتنشيط الضوئي.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً قيماً للباحثين.
- يعد فهم كفاءة التنشيط الضوئي أمراً بالغ الأهمية للتصميم التجريبي.
- يمكن للأبحاث المستقبلية الاستناد إلى هذه النتائج لتحسين استخدام البروتينات الفلورية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
إن قياس كفاءة التنشيط الضوئي للبروتينات الفلورية يعالج فجوة حرجة في تصوير الخلايا الحية، مما يتيح تفسيراً أكثر موثوقية لسلوك البروتين الديناميكي. تدعم هذه القدرة عملية التحقق من الأهداف وتطوير المقايسات من خلال توفير معلمة قابلة للقياس لأداء المسبار القابل للتنشيط الضوئي. كما أن تحسين الثقة التنبؤية في تنشيط المسبار يقلل من الغموض الميكانيكي في التطبيقات اللاحقة مثل الفرز المظهري ودراسات المؤشرات الحيوية الترجمية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تمكّن من استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس جزء البروتينات القابلة للتنشيط الضوئي التي تم تنشيطها بنجاح.
- القيمة التشغيلية: توفر تحكمًا داخليًا نسبيًا لمعايرة التباين في التعبير البروتيني من خلية إلى أخرى.
- القيمة التنبؤية: تدعم تحديد المركبات الرائدة من خلال السماح بمقارنة كفاءات التنشيط الضوئي عبر مختلف متغيرات البروتين أو الظروف.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تولد قراءات كمية ومعيارية لكفاءة التنشيط الضوئي من أجل تحسين المقايسة.
- قابليتها للتكرار: تستخدم مساطر داخلية مقترنة جينياً لضمان اتساق التعبير النسبي عبر المكررات التجريبية.
- قابليتها للتوسع: متوافقة مع تنسيقات العينات الضخمة والخلايا الحية، مما يتيح دمجها في سير عمل الفحص عالي المحتوى.
الأبحاث الترجمية والسريرية الأولية
- الاستمرارية الترجمية: تسهل الحد من المخاطر الميكانيكية من خلال ربط كفاءة التنشيط الضوئي بالقراءات الوظيفية في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
- الثقة التنبؤية: تمكّن من اتخاذ قرارات التقدم المعدلة وفقاً للمخاطر استناداً إلى الأداء الكمي للتنشيط الضوئي.
- المواءمة مع المؤشرات الحيوية: تدعم تطوير المراسلين القابلين للتنشيط الضوئي للتتبع الطولي في النماذج قبل السريرية.
تكامل مسار العمل ومنظومة التشغيل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق الأولي من الهدف، مروراً بتطوير المقايسة، وصولاً إلى التقييم قبل السريري، لا سيما في الحالات التي تتطلب تحكماً زمانياً ومكانياً في نشاط البروتين.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال تحديد كمية الجزء المنشط من المجسات القابلة للتنشيط الضوئي في الخلايا الحية.
- الفحص: تتيح توحيد المقايسات من خلال القياس النسبي المستقل عن مستويات التعبير المطلقة.
- التحليلات: توفر قياسات كمية للمتغير التابع (جزء التنشيط الضوئي) مما يسمح بمقارنة أنماط التنشيط.
- الأبحاث الانتقالية: ترتبط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال تمكين التقييم الموحد للمراسلين القابلين للتنشيط الضوئي في نماذج الأمراض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتقييم أي زوج من البروتينات الفلورية القابلة للتنشيط الضوئي المتميزة طيفياً.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في أداء المجسات القابلة للتنشيط الضوئي وتقلل من النتائج السلبية الكاذبة في المقايسات القائمة على التنشيط.
- القيمة التشغيلية: تعزز قابلية التكرار والتوحيد القياسي عبر المختبرات والإعدادات التجريبية المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف في اختيار المجسات من خلال توفير بيانات كمية عن كفاءة التنشيط.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات الأدوات القابلة للتنشيط الضوئي بناءً على مقاييس أداء تم التحقق من صحتها مع تعديل المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الاستنساخ الجزيئي لإنتاج خيمرات من البروتينات الفلورية المقترنة جينياً.
- يعتمد على توفر مجهر فلوري متحد البؤر (confocal) أو واسع المجال (widefield) مزود بقدرات التنشيط الضوئي.
- يستلزم توحيد معايير معاملات التصوير وبروتوكولات التنشيط الضوئي بين المستخدمين.
- يتطلب التحقق من وظيفة الخيمرات والفصل الطيفي في الخط الخلوي المستهدف.
- يقتصر على الأنظمة التي لا يؤدي فيها الاقتران الجيني للفلوروفورات إلى إعاقة وظيفة البروتين أو تموضعه.
