بنية حل أزرق نيون البروتين باستخدام ميشاندكوليكت
مارس 19, 2019
ونقدم استخدام بروتوكول ميشاندكوليكت للحصول على مجموعة بيانات حيود كاملة، لاستخدامها في تصميم هيكل اللاحقة، تتألف من مجموعات البيانات حيود الجزئية التي تم جمعها من العديد من بلورات صغيرة من البروتين نيون أزرق.
تم تطوير بروتوكول MeshAndCollect الآلي للجمع بين علم البلورات التسلسلي مع جمع بيانات الدوران القياسي لقياس البلورات الصغيرة من عينات عفريت. تحدد الطريقة أولاً موضع البلورات المثبتة على حامل العينة نفسه لتوجيه مجموعة البيانات الجزئية التي سيتم دمجها فيما بعد واستخدامها في حل الهيكل. MeshAndCollect مقنعة لأنها تسمح لك بإجراء تجارب بسرعة وبنفس الإعداد ، حل الهيكل ، وفحص الليجند ، وكل ذلك مع بلورات صغيرة.
هذه الطريقة متوافقة مع الخط الشعاعي السنكروترون VMX مجهزة بشكل مثالي مع فليكس الفوتون عالية، وقطر شعاع صغير، وكاشف إعادة تحميل سريع. أولاً، الاتصال بنظام المعلومات الموسع لقاعدة بيانات خط شعاع بلوريوغرافي البروتين واختيار MX.Log في مع رقم التجربة وكلمة المرور من النموذج A. بعد ذلك، حدد الشحن إضافة جديد وملء المعلومات المطلوبة.
حدد إضافة جزئية وملء البيانات ذات الصلة. حدد إضافة حاوية، واختيار عفريت SC3، وملء المعلومات المطلوبة بما في ذلك مواقف أصحاب العينة في عفريت. في الكوخ التجريبي ، قم بتحميل عفريت في دور المغير عينة ونلاحظ موقفها.
بعد ذلك، تسجيل الدخول إلى نظام المعلومات لقاعدة بيانات شعاع البلورات البروتينية. حدد تحضير التجربة، ابحث عن الشحنة، حدد التالي، وحدد خط الشعاع ووضع عفريت في مغير العينة. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج التحكم بخط الشعاع مع الرقم التجريبي وكلمة المرور المتوفرة في النموذج A.
اضغط على مزامنة لمزامنة برنامج التحكم بخط الشعاع مع نظام المعلومات لقاعدة بيانات خط شعاع بلوريوغرافي البروتين. استخدم برنامج التحكم بخط الشعاع لتركيب حامل العينة على مقياس الزمنة. ثم انقر بزر الماوس الأيمن فوق موضع في منطقة تغيير العينة وحدد نموذج التحميل.
حدد زر الوسط ثم مركز ثلاث نقرات في منتصف حافة طرف الحلقة. حفظ موضع توسيط عن طريق تحديد حفظ. ضمن "خيارات متقدمة"، قم بإضافة إعادة توجيه Visual سير العمل إلى قائمة انتظار تجميع البيانات.
ثم قم بتشغيل سير العمل بالنقر على تجميع قائمة الانتظار. بعد ذلك، حدد أحد مواضع المراكز المحفوظة بالنقر فوقه. انقر مرة أخرى على زر الوسط ، ثم مركز ثلاث نقرات في منتصف بداية جذع الحلقة.
حفظ الموضع الثاني عن طريق النقر على حفظ. ثم انقر على متابعة. بعد سير العمل محاذاة الطائرة من حامل العينة مع محور دوران goniometer، مركز حامل العينة مرة أخرى في مكان ما في منتصف شبكة.
توجيه حامل العينة بحيث يكون وجه الشبكة عمودياً على اتجاه شعاع الأشعة السينية عن طريق تدوير محور أوميغا باستخدام برنامج التحكم بخط الحزم. في برنامج التحكم بخط الشعاع، انقر على القائمة المنسدلة Aperture وحدد قيمة. ثم انقر على أيقونة أداة شبكة لإحضار نافذة أداة شبكة.
في عرض عينة من برنامج التحكم خط شعاع، رسم شبكة بواسطة النقر على اليسار وسحب الماوس فوق المنطقة التي تحتوي على بلورات على حامل العينة. لحفظ الشبكة، انقر على زر الجمع في نافذة أداة الشبكة. في مجال دقة برنامج التحكم بخط الشعاع، أدخل الدقة التي يجب أن يتم بها جمع صور الحيود.
إذا لم تكن هناك معلومات مسبقة عن جودة الانعراج للبلورات، يوصى بقيمة بين اثنين و2.5. حدد MeshAndCollect في علامة التبويب "تجميع بيانات متقدمة". إضافته إلى قائمة الانتظار ثم انقر فوق تجميع قائمة الانتظار.
في إطار المعلمة، استخدم معلمات افتراضية تابعة لخط الشعاع. في التجربة الموضحة هنا، المعلمات الافتراضية هي 0.037 ثانية وقت التعرض لكل نقطة مسح شبكة، 100٪ انتقال، وتذبذب درجة واحدة لكل شبكة خط المسح الضوئي. انقر فوق متابعة.
يتم تحليل مسح الشبكة وصور الحيود التي تم جمعها في كل نقطة شبكة وترتيبها وفقًا لقوة الحيود مع برنامج Dozer. بعد تحليل Dozer، يتم إنشاء خريطة حرارية ويتم تعيين أمر مجموعات البيانات الجزئية اللاحقة تلقائيًا استنادًا إلى قوة الحيود. وأخيراً، انقر فوق متابعة لبدء مجموعات البيانات الجزئية.
وقد استخدم برنامج MeshAndCollect كما هو مطبق في MXCuBE لجمع مجموعات بيانات الحيود الجزئي من بلورات سيرولان الصغيرة الموجودة على نفس حامل العينة الذي كان من الصعب التعرف البصري على البلورات. ولفحص حامل العينة، تم رسم شبكة فوق مركز حلقة الشبكة، واستناداً إلى خريطة الحرارة درجة Dozer، تم جمع 85 مجموعة بيانات الحيود الجزئية تلقائياً. تم دمج هذه بشكل فردي ثم اندمجت لإنتاج مجموعة بيانات مع اكتمال 99.8٪في قرار من 1.7 angstroms.
كما هو متوقع، يمكن حل الهيكل البلوري لـ Cerulean عن طريق الاستبدال الجزيئي باستخدام مجموعة البيانات التي تم إنشاؤها. بعد صقل, حصل [ر] عمل من 22.8٪و [ر] حرّة من 25.4٪. موقف السوبر من هيكل يحدد سابقا يظهر RMSD العالمية على وظائف ج ألفا من 0.1 angstroms.
بالنسبة للمشاريع التي يكون فيها تحسين مرحلة النمو البلوري الأمثل، يوفر MeshAndCollect إمكانية الحصول على مجموعة بيانات كاملة تستند إلى الجمع بين هذه المجموعات الجزئية غير المتبلورة من البيانات التي تم الحصول عليها من بلورات أصغر. مهدت هذه التقنية الطريق لعلماء الأحياء الهيكلية لحل هيكل من عينة أجزاء حيث لا يمكن إنتاج سوى بضعة أعشار من البلورات الدقيقة.
نظرة عامة
يُمكّن بروتوكول MeshAndCollect من جمع مجموعات بيانات الحيود الكاملة من البلورات الصغيرة، وتحديداً للبروتين الفلوريسنت Cerulean. تدمج هذه الطريقة علم البلورات التسلسلي مع مجموعة بيانات الدوران القياسية، مما يسهل التجارب السريعة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء البنيوي
- علم البلورات
- تحليل البروتين
الخلفية
- MeshAndCollect يجمع البيانات من عدة بلورات صغيرة.
- مصمم للاستخدام مع خطوط حزم السنكروترون.
- البروتكول يعزز كفاءة تحديد البنية.
- يعالج التحديات في التعرف البصري على البلورات الصغيرة.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة للحصول على مجموعات بيانات الحيود الكاملة.
- لتسهيل تحديد البنية من البلورات الصغيرة.
- لتحسين سرعة وكفاءة التجارب.
الطرق المستخدمة
- الجمع الآلي لمجموعات البيانات الجزئية من البلورات الصغيرة.
- تكامل البيانات باستخدام برنامج Dozer للتحليل.
- استخدام أداة شبكة لتحسين وضع العينة.
- تطبيق المعلمات الافتراضية لجمع البيانات.
النتائج الرئيسية
- تم جمع 85 مجموعة بيانات حيود جزئية بإكتمال 99.8%.
- الدقة التي تم تحقيقها كانت 1.7 أنجستروم.
- تم حل بنية بلورة Cerulean بنجاح.
- أسفر التنقيح عن R work بنسبة 22.8% و R free بنسبة 25.4%.
الخلاصات
- MeshAndCollect يسمح بجمع البيانات بشكل فعال من البلورات الصغيرة.
- تدعم هذه التقنية علماء الأحياء البنيويين في حل الهياكل المعقدة.
- توفر حلاً للمشاريع ذات نمو بلوري محدود.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Structural determination of fluorescent proteins like Cerulean supports target validation and assay development in biopharma R&D by enabling mechanistic de-risking of protein function and interaction studies. The MeshAndCollect protocol addresses a key bottleneck in early discovery: obtaining high-quality structural data from poorly diffracting or micro-crystalline samples that hinder traditional X-ray crystallography workflows. This capability enhances predictive confidence in lead identification and supports portfolio triage by providing reliable structural insights for structure-based drug design.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution structural data from weakly diffracting crystals.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying protein-ligand interactions and functional sites critical for target validation.
- Predictive Value: Improves confidence in structural models used for virtual screening and lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides validated structural templates for assay standardization and reproducibility in fluorescence-based screening platforms.
- Operational Value: Facilitates preparation of consistent biological systems for downstream compound evaluation and ligand screening campaigns.
- Scalability: Enables reuse of micro-crystal data collection workflows across multiple targets in structural genomics initiatives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with disease-relevant systems by providing structural insights into fluorescent protein behavior in cellular environments.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target mechanism by confirming structural integrity under experimental conditions.
- Preclinical Readiness: Enables risk-adjusted advancement decisions through reliable structural data for biomarker and probe development.
Pipeline & Workflow Integration
The MeshAndCollect protocol fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical support, particularly for projects challenged by difficult crystallization or limited sample availability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by delivering high-resolution structural data from micro-crystals.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized, reproducible structural inputs for ligand binding and conformational studies.
- Analytics: Generates quantitative diffraction data sets with high completeness (99.8%) and defined resolution (1.7 Å) for reliable comparative analysis.
- Translational Research: Connects structural findings to preclinical continuity by enabling biomarker alignment and probe development.
- Enterprise Reuse: Functions as a scalable, automated capability for structural data acquisition across multiple targets and campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target structure, reduction of mechanistic ambiguity, and improved model accuracy.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and rapid data collection from non-ideal crystals.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency in crystallography campaigns, and reduced biological risk in lead optimization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable structural data for advancement or termination decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein crystallography and synchrotron beamline operations.
- Dependent on access to VMX-equipped beamlines with high photon flux, small beam size, and fast detectors.
- Necessitates standardized sample preparation and puck-based loading protocols for consistent mesh-based positioning.
- Involves cross-team alignment between structural biology, assay development, and computational modeling groups.
- Limited by crystal quality and diffraction strength, though effective even with weakly diffracting micro-crystals.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Offline Preparation of the Synchrotron Experiment
1:31
Loading of the Sample onto a Beamline
3:49
Prepare and Execute the MeshAndCollect Workflow
5:02
Results: Structure Determination of the Fluorescent Protein Cerulean using MeshAndCollect
6:10
Conclusion
