كشف البلطي بحيرة الفيروسات باستخدام التقليدية RT-PCR وسيبر الأخضر RT-قبكر

مرحباً بالجميع اسمي وين سوراشتبونغ. أنا أستاذ مساعد في علم الأحياء الدقيقة البيطرية وكلية علم المناعة للطب البيطري في جامعة Kasetstart، تايلاند.

أنا وفريقي متخصصون في الأمراض الفيروسية الناشئة في البلطي. ونحن نعمل الآن على فيروس بحيرة البلطي الذي يسبب وفيات عالية في البلطي. وبما أن البلطي هو ثاني أهم أنواع الأسماك التي تُزرع في جميع أنحاء العالم، فإنه يوفر مصدر البروتين لمليون شخص ويلعب دوراً هاماً في الأمن الغذائي.

لذا فإن التفشي الأخير لفيروس بحيرة البلطي يسبب تأثيرًا اجتماعيًا واقتصاديًا أدى بالعديد من العلماء إلى محاولة إيجاد حل لهذه المشكلة. حتى الآن نحن بحاجة إلى طريقة حساسة جدا وسريعة ودقيقة للكشف عن الفيروس. في هذا الفيديو، سوف نعرض لك خطوة بخطوة للكشف عن فيروس بحيرة البلطي في أنسجة السمك بدءا من جمع العينات، عينة من السكان، وتحليل PCR في الوقت الحقيقي.

أولاً، تُولّد جرعة زائدة من زيت القماش في الماء للقتل الرحيم للأسماك. ضع السمك الميت على صينية، تعقيم المعدات باستخدام الإيثانول 95٪، ثم حرقها مع الموقد الكحول. قطع ببطء فتح الأسماك من أسفل البطن صعودا، لجمع الكبد.

جمع جزء من الكبد في أنبوب جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر. وينبغي أن يتم تنفيذ الجزء الأول من استخراج الحمض النووي الريبي في هود تدفق لامنار، وارتداء معدات واقية. إضافة ملليلتر واحد من مُكشف استخراج الحمض النووي الريبي في الأنبوب.

اطحن الكبد باستخدام الأنسجة في مضايق متجانسة. إضافة 200 ميكرولترات من الكلوروفورم في الأنبوب. ثم، مزيج بلطف عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات.

يُترك جانباً لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية عند 12000 RCF لمدة 15 دقيقة. جمع الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي.

نقل بلطف 500 ميكرولترات من الطور مائي العلوي عديم اللون إلى أنبوب جديد. إضافة وحدة تخزين واحدة من ايزوبروبانول في الأنبوب. الحرارة في ناقص 20 درجة مئوية لمدة ساعتين أو ما يصل إلى بين عشية وضحاها لتسريع الجيش الملكي النيبالي.

بعد الحضانة, جهاز طرد مركزي الحل في نفس حالة الطرد المركزي. جمع الأنابيب من جهاز الطرد المركزي، ثم تجاهل المناط. ويمكن رؤية بيليه الجيش الملكي النيبالي كما أشار السهم.

إضافة ملليلتر واحد من 75٪ الإيثانول في أنبوب لغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي, وعكس عدة مرات. جهاز طرد مركزي عند أربع درجات مئوية، عند 10,000 RCF لمدة 15 دقيقة. جمع الأنابيب من جهاز الطرد المركزي، ثم تجاهل المناط.

ارسم بقايا الإيثانول باستخدام الأنابيب التلقائية، والهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق. إضافة 30 إلى 60 microliters RNase المياه الحرة، قبل warmed إلى 55 إلى 60 درجة مئوية ل solubilize بيليه رنا. استخدام واحد إلى اثنين microliters من محلول الحمض النووي الريبي لقياس التركيز باستخدام مقياس الطيف الصغير الحجم.

ستظهر النتائج على الشاشة. تخفيف التركيز إلى 200 نانوغرام لكل ميكرولتر باستخدام RNase المياه الحرة. تنفيذ توليف cDNA باستخدام المواد الكيميائية والشروط المذكورة على النحو التالي.

استخدام ثيرموسيفير لتحويل RNA إلى cDNA مع الشروط المقترحة. وفيما يلي المواد الكيميائية والشروط المستخدمة لتحديد حمولة TiLV باستخدام PCR في الوقت الحقيقي. الاستغناء عن ستة ملليلتر من مزيج سيد qPCR في كل قارورة من أنبوب شريط qPCR الأبيض.

وفي وقت لاحق، يتم تحميل أربعة ملليلترات من عينة cDNA في البئر. في هذه المرحلة يجب تغيير طرف أنبوب جديد في كل بئر واحد ، لتجنب التلوث من عينة إلى عينة. ختم شريط qPCR بإحكام مع غطاء شريط qPCR شفافة.

خلط بلطف الحل عن طريق الخفقان في طرف من الشريط. ثم تدور أسفل باستخدام أجهزة الطرد المركزي الصغيرة لجمع كل السائل في الجزء السفلي من السفن. استخدام شرط الخطوة اثنين كما هو مبين في الفيديو، حدد البئر في لوحة 96 جيدا التي كنت تنوي استخدامها.

حدد أخضر السيبرانية والنباتات للصبغ. حدد غير معروف كنوع العينة، وقم بإدراج اسم في مربع اسم نموذج. افتح غطاء جهاز PCR في الوقت الحقيقي ووضع شريط qPCR في البئر المخصص.

ثم أغلق الغطاء. تشغيل الجهاز مع الشرط المحدد. سيبدأ الجهاز ويركض بعد أن يصل الغطاء إلى درجة الحرارة المطلوبة.

بعد نهاية شروط qPCR، يتم عرض منحنى التضخيم. هنا، يشير السهم معدل إلى حيث الحد الأدنى يقطع قبالة بين المرحلة الأسية والمرحلة الخطية التي ينتج في قيمة CT. ثم يتم استقراء قيمة CT في عدد نسخة سجل الفيروسات لحساب عدد من بقايا الفيروس باستخدام المنحنى القياسي.

كما يتم عرض ذروة الذوبان لتحديد ما إذا كان الفيروس المكتشف بواسطة qPCR هو، في الواقع، TiLV حيث تتراوح القمم الذائبة عادة بين 79.5 و 80.5 درجة مئوية. لذلك نأمل أن تكون هذه الطريقة أدوات مهمة للمزارعين و المنظمة في جميع أنحاء العالم ، الذين قد يحتاجون إلى تنفيذ مكافحة والحد من انتشار العدوى TiLV.