Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Pamela Nicholson; Pattarasuda Rawiwan; Win Surachetpong

doi:10.3791/58596

كشف البلطي بحيرة الفيروسات باستخدام التقليدية RT-PCR وسيبر الأخضر RT-قبكر

JoVE Journal
Environment
Author Produced

This content is Free Access.

JoVE Journal Environment

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

كشف البلطي بحيرة الفيروسات باستخدام التقليدية RT-PCR وسيبر الأخضر RT-قبكر

Full Text

28,100 Views

10:55 min

November 10, 2018

DOI: 10.3791/58596-v

Pamela Nicholson¹, Pattarasuda Rawiwan², Win Surachetpong²

¹Institute of Veterinary Bacteriology Vetsuisse Faculty,University of Bern, ²Department of Veterinary Microbiology and Immunology and Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Kasetsart University Institute for Advanced Studies,Kasetsart University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This protocol details the diagnosis of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. It encompasses the entire process from tissue dissection to RNA extraction, cDNA synthesis, and TiLV detection through conventional or quantitative PCR.

Key Study Components

Area of Science

Veterinary Microbiology
Virology
Fish Health Management

Background

Tilapia Lake Virus causes significant mortality in tilapia, impacting food security.
Tilapia is the second most important fish species globally.
Rapid and accurate detection methods are essential for managing outbreaks.
This protocol aims to provide a reliable method for TiLV detection.

Purpose of Study

To develop a highly sensitive method for detecting TiLV in fish tissues.
To assist farmers and organizations in controlling TiLV spread.
To provide a step-by-step guide for researchers and practitioners.

Methods Used

Sample collection and euthanization of fish using cloth oil.
RNA extraction from liver tissue using a laminar flow hood.
cDNA synthesis followed by real-time PCR for TiLV detection.
Analysis of amplification curves and CT values to quantify TiLV load.

Main Results

Successful extraction and quantification of RNA from tilapia tissues.
Detection of TiLV using real-time PCR with specific conditions.
Establishment of a standard curve for virus quantification.
Identification of TiLV through melting peak analysis.

Conclusions

The protocol provides a reliable method for TiLV detection.
It can aid in managing outbreaks and ensuring food security.
Future applications may enhance viral disease control in aquaculture.

Frequently Asked Questions

What is Tilapia Lake Virus?

Tilapia Lake Virus is a viral pathogen that causes high mortality rates in tilapia, affecting aquaculture and food security.

Why is rapid detection of TiLV important?

Rapid detection allows for timely intervention to control outbreaks and minimize economic losses in aquaculture.

What methods are used in this protocol?

The protocol includes RNA extraction, cDNA synthesis, and real-time PCR for detecting TiLV.

How does real-time PCR work for TiLV detection?

Real-time PCR amplifies specific DNA sequences, allowing for quantification of the virus based on CT values.

What are the implications of this research?

This research provides a framework for controlling TiLV outbreaks, which is crucial for the sustainability of tilapia farming.

Can this method be applied to other fish species?

While this protocol is specific to tilapia, similar methods may be adapted for other fish species affected by viral diseases.

هذا البروتوكول تشخيص "الفيروس بحيرة البلطي" (تيلف) في أنسجة البلطي استخدام منهجيات RT-PCR. ويرد وصف الأسلوب كامل من تشريح الأنسجة إلى مجموع استخراج الحمض النووي الريبي، تليها كدنا التوليف وكشف تيلف بكر التقليدية أو PCR الكمي دسدنا ملزمة صبغة فلورسنت ملزم باستخدام.

مرحباً بالجميع اسمي وين سوراشتبونغ. أنا أستاذ مساعد في علم الأحياء الدقيقة البيطرية وكلية علم المناعة للطب البيطري في جامعة Kasetstart، تايلاند.

أنا وفريقي متخصصون في الأمراض الفيروسية الناشئة في البلطي. ونحن نعمل الآن على فيروس بحيرة البلطي الذي يسبب وفيات عالية في البلطي. وبما أن البلطي هو ثاني أهم أنواع الأسماك التي تُزرع في جميع أنحاء العالم، فإنه يوفر مصدر البروتين لمليون شخص ويلعب دوراً هاماً في الأمن الغذائي.

لذا فإن التفشي الأخير لفيروس بحيرة البلطي يسبب تأثيرًا اجتماعيًا واقتصاديًا أدى بالعديد من العلماء إلى محاولة إيجاد حل لهذه المشكلة. حتى الآن نحن بحاجة إلى طريقة حساسة جدا وسريعة ودقيقة للكشف عن الفيروس. في هذا الفيديو، سوف نعرض لك خطوة بخطوة للكشف عن فيروس بحيرة البلطي في أنسجة السمك بدءا من جمع العينات، عينة من السكان، وتحليل PCR في الوقت الحقيقي.

أولاً، تُولّد جرعة زائدة من زيت القماش في الماء للقتل الرحيم للأسماك. ضع السمك الميت على صينية، تعقيم المعدات باستخدام الإيثانول 95٪، ثم حرقها مع الموقد الكحول. قطع ببطء فتح الأسماك من أسفل البطن صعودا، لجمع الكبد.

جمع جزء من الكبد في أنبوب جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر. وينبغي أن يتم تنفيذ الجزء الأول من استخراج الحمض النووي الريبي في هود تدفق لامنار، وارتداء معدات واقية. إضافة ملليلتر واحد من مُكشف استخراج الحمض النووي الريبي في الأنبوب.

اطحن الكبد باستخدام الأنسجة في مضايق متجانسة. إضافة 200 ميكرولترات من الكلوروفورم في الأنبوب. ثم، مزيج بلطف عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات.

يُترك جانباً لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية عند 12000 RCF لمدة 15 دقيقة. جمع الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي.

نقل بلطف 500 ميكرولترات من الطور مائي العلوي عديم اللون إلى أنبوب جديد. إضافة وحدة تخزين واحدة من ايزوبروبانول في الأنبوب. الحرارة في ناقص 20 درجة مئوية لمدة ساعتين أو ما يصل إلى بين عشية وضحاها لتسريع الجيش الملكي النيبالي.

بعد الحضانة, جهاز طرد مركزي الحل في نفس حالة الطرد المركزي. جمع الأنابيب من جهاز الطرد المركزي، ثم تجاهل المناط. ويمكن رؤية بيليه الجيش الملكي النيبالي كما أشار السهم.

إضافة ملليلتر واحد من 75٪ الإيثانول في أنبوب لغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي, وعكس عدة مرات. جهاز طرد مركزي عند أربع درجات مئوية، عند 10,000 RCF لمدة 15 دقيقة. جمع الأنابيب من جهاز الطرد المركزي، ثم تجاهل المناط.

ارسم بقايا الإيثانول باستخدام الأنابيب التلقائية، والهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق. إضافة 30 إلى 60 microliters RNase المياه الحرة، قبل warmed إلى 55 إلى 60 درجة مئوية ل solubilize بيليه رنا. استخدام واحد إلى اثنين microliters من محلول الحمض النووي الريبي لقياس التركيز باستخدام مقياس الطيف الصغير الحجم.

ستظهر النتائج على الشاشة. تخفيف التركيز إلى 200 نانوغرام لكل ميكرولتر باستخدام RNase المياه الحرة. تنفيذ توليف cDNA باستخدام المواد الكيميائية والشروط المذكورة على النحو التالي.

استخدام ثيرموسيفير لتحويل RNA إلى cDNA مع الشروط المقترحة. وفيما يلي المواد الكيميائية والشروط المستخدمة لتحديد حمولة TiLV باستخدام PCR في الوقت الحقيقي. الاستغناء عن ستة ملليلتر من مزيج سيد qPCR في كل قارورة من أنبوب شريط qPCR الأبيض.

وفي وقت لاحق، يتم تحميل أربعة ملليلترات من عينة cDNA في البئر. في هذه المرحلة يجب تغيير طرف أنبوب جديد في كل بئر واحد ، لتجنب التلوث من عينة إلى عينة. ختم شريط qPCR بإحكام مع غطاء شريط qPCR شفافة.

خلط بلطف الحل عن طريق الخفقان في طرف من الشريط. ثم تدور أسفل باستخدام أجهزة الطرد المركزي الصغيرة لجمع كل السائل في الجزء السفلي من السفن. استخدام شرط الخطوة اثنين كما هو مبين في الفيديو، حدد البئر في لوحة 96 جيدا التي كنت تنوي استخدامها.

حدد أخضر السيبرانية والنباتات للصبغ. حدد غير معروف كنوع العينة، وقم بإدراج اسم في مربع اسم نموذج. افتح غطاء جهاز PCR في الوقت الحقيقي ووضع شريط qPCR في البئر المخصص.

ثم أغلق الغطاء. تشغيل الجهاز مع الشرط المحدد. سيبدأ الجهاز ويركض بعد أن يصل الغطاء إلى درجة الحرارة المطلوبة.

بعد نهاية شروط qPCR، يتم عرض منحنى التضخيم. هنا، يشير السهم معدل إلى حيث الحد الأدنى يقطع قبالة بين المرحلة الأسية والمرحلة الخطية التي ينتج في قيمة CT. ثم يتم استقراء قيمة CT في عدد نسخة سجل الفيروسات لحساب عدد من بقايا الفيروس باستخدام المنحنى القياسي.

كما يتم عرض ذروة الذوبان لتحديد ما إذا كان الفيروس المكتشف بواسطة qPCR هو، في الواقع، TiLV حيث تتراوح القمم الذائبة عادة بين 79.5 و 80.5 درجة مئوية. لذلك نأمل أن تكون هذه الطريقة أدوات مهمة للمزارعين و المنظمة في جميع أنحاء العالم ، الذين قد يحتاجون إلى تنفيذ مكافحة والحد من انتشار العدوى TiLV.