تقدير عدد النيفرون في الكلي الكامل باستخدام طريقه النقع الحمضي

يمكن أن تساعد طريقة التآكل الحمضي في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الكلية وكيف تساهم جينات محددة في تطوير النبيرون أو تؤثر فيه وكذلك كيفية تأثير حالات محددة، مثل مرض السكري أو ارتفاع ضغط الدم، على عدد النبيرون. وهذا أمر مهم لأن العدد الإجمالي لnehrons الأفراد الذين ولدوا مع يتم تحديد أثناء نمو الجنين وفقدان nephrons وقد ارتبط مع أمراض الكلى. المزايا الرئيسية لطريقة الهضيب الحمضية هي أنها أسرع وأكثر قابلية للاستنساخ وغير مكلفة وأقل استهلاكًا للوقت من طرق عد الكلى الأخرى ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي.

هذه التقنية تسهل الارتباط من تأثير في عدد النيفرون على وظيفة الكلى، وهو أمر مهم لتعزيز فهمنا لكيفية الجينات محددة تؤثر على وظيفة النيفرون والتنمية. دراسة الجينات أو العوامل التي تؤثر على عدد الكلي nephron سيكون له دور فعال في تطوير الطرق الدوائية أو الوراثية المصممة للحد من فقدان النيفرون المرتبطة بالأمراض. مع تقنية تجريبية جيدة والممارسة، وينبغي أن الأفراد الجدد لهذه الطريقة بسهولة الحصول على إتقان أسلوب الماكينة الحمضية السماح تقديرات موثوقة وقابلة للاستنساخ من أرقام الكلية الكلية بأكملها nephron.

ابدأ باستخدام مقص جراحي جيد لفتح تجويف البطن في الماوس على طول خط الوسط. تحويل بعناية الأمعاء والdipose التناسلية إلى الجانب الأيمن من الحيوان. باستخدام التشريح الإجمالي، عزل الكلى اليسرى وقطع الشريان الكلوي الأيسر والوريد لإزالة بعناية الكلى وضع الجهاز في قارب وزن المسمى بشكل مناسب من برنامج تلفزيوني.

جمع الحق في الكلى بنفس الطريقة ووضع كل من الكلى على الشاش الجراحية قبل مبللة مع برنامج تلفزيوني. إزالة بسرعة أي الأنسجة غير الكلوية وأتباعه وكبسولات الكلى. ثم وزن كل كلية تسجيل كل على حدة وزن الجهاز الأيسر والأيني على حدة.

بعد وزنها، ضع كل كلية مرة أخرى إلى قارب يزن المسمى بشكل مناسب دون برنامج تلفزيوني واستخدم شفرة حلاقة نظيفة لقطع كل عضو في نصف طول. وضع كل نصف قطع الجانب كلية أسفل وقطع كل نصف إلى اثنين ملليمتر أو أصغر قطعة. باستخدام شفرة الحلاقة نفسها، قم بنقل قطع الكلى المفرومة بعناية إلى أنبوب مخروطي يحمل علامة مناسبة 15 ملليلتر.

في غطاء الدخان جيدة التهوية، إضافة خمسة ملليلتر من حمض الهيدروكلوريك المولر ستة إلى كل أنبوب. بعد ذلك، يهيج بلطف خليط حمض الكلى قبل وضع الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. في نهاية الهضيب الحمضي، قم بتوصيل إبرة قياس 18 إلى حقنة واحدة بخمس ملليلتر لكل كلية وإزالة المكبس المحاقن بعناية.

ضع المحاقن في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر فردية في غطاء الدخان وصب حلول الكلى في الطرف المفتوح لكل حقنة تضع الأنابيب الفارغة جانباً في رف أنبوب الاختبار. ثم استبدال بعناية المكبس للبثق بطيئة من كل حل من خلال الإبر في أنابيب 50 ملليلتر. غسل أنابيب مخروطية 15 ملليلتر مع خمسة ملليلتر من حل PBS لكل أنبوب يحوم برنامج تلفزيوني ل solubilize أي أنسجة الكلى المتبقية.

بثق محتويات الغسيل في أنبوب 50 ملليلتر المناسبة كما أظهرت للتو. بعد البثق غسل الثالثة، وتجهيز كل حقنة مع إبرة قياس 21. بثق محتويات أنابيب 50 ملليلتر في مجموعة ثانية من أنابيب 50 ملليلتر من خلال غسل إبرة أصغر تحمل وقذف أول 50 ملليلتر محتويات أنبوب ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني جديد كما هو موضح.

بعد الغسيل الثالث والبثق، جلب الحجم الإجمالي في كل أنبوب تصل إلى 50 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني إضافي ووضع الأنابيب في رف على لوحة الروك في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في غضون خمسة أيام من المعالجة، ضع شبكة تحتوي على 16 قسمًا منفصلًا على الجزء السفلي من ستة آبار من 12 بئرًا. عكس بلطف أنابيب الكلى حل عدة مرات ل resuspend الأنسجة بيليه.

إضافة بعناية ثلاثة 500 ميكرولتر aliquots من كل حل متجانس لكلية إلى كل من ثلاثة آبار من 12 بئر لوحة. تمييع محتويات كل بئر مع حجم متساو من برنامج تلفزيوني. ضع الصحن على خشبة المجهر المقلوب.

تحديد الكبيات من قبل هيكلها كروية، هوى المحمر، والشريان قبل أو آخر تعلق على الهيئات من الكبيبات الفردية. حساب عدد من glomeruli لكل قسم الشبكية إلى مجموع العد لكل شبكة لحساب العدد الإجمالي من glomeruli في بئر. ثم مضاعفة عدد من glomeruli في كل مرة 100 إلى الحصول على متوسط عدد من الكبيبات لكلية.

في هذه التجربة التمثيلية ، كان إجمالي عدد النبيرون في الفئران المشبعة بالمركبات لمدة 14 يومًا حوالي 12500 نيفرون لكل كلية. أنجيوتنسين ضخ اثنين ومع ذلك، زيادة الضغط الأذيني بنحو 40 ملليمتر من الزئبق وارتبطت مع انخفاض كبير ما يقرب من 26٪ في العدد الكلي النيفرون. في هذا النموذج الجيني للشيخوخة الكلوية الفئران، تم حساب الحيوانات التي ولدت مع كليتين لاحتواء حوالي 27،500 nephrons لكلية بعد الهش الحمض كما أظهرت، في حين تم العثور على الفئران التي ولدت مع كلية الانفرادي أن لديها أقل بكثير مجموع أرقام النبيرون.

وكانت التقديرات المستمدة من كلتا التجربتين متسقة مع النطاقات التي تم الإبلاغ عنها سابقاً في الفئران. طريقة الهضيب الحمضية مثالية لتقدير أعداد النيفرون في الكلى الكاملة ، خاصة في المختبرات غير المجهزة بتقنيات أكثر كثافة في العمالة والتكلفة باهظة لعد النيفرون ، مثل طريقة كسور كسورية disector أو التصوير بالرنين المغناطيسي. هذه الطريقة تسمح عالية الإنتاجية، كفاءة، وتقدير استنساخ من الكلى كامل عدد nephron التي هي ضمن 5٪ من الأرقام التي يحددها التصوير بالرنين المغناطيسي.

تقييم عدد النيفرون هو من أهمية سريرية كما انخفض عدد النيفرون ارتبطت مع زيادة خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية, مثل أمراض الكلى المزمنة. لا تنس أن العمل مع حمض الهيدروكلوريك يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه ينبغي اتخاذ الاحتياطات، مثل ارتداء القفازات، النظارات الواقية، ومعطف المختبر.