الهضم الكبد مورين لتحليل تدفق سيتوميتريك اللمفاوية خلايا غشائي

والهدف من هذا البروتوكول تحديد الخلية اللمفاوية غشائي السكان داخل الكبد باستخدام علامات وصف. فنحن نستخدم كولاجيناز الرابع والدناز وتنميق رقيقة من الأنسجة، جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي، لتحديد عدد سكانها متميزة من خلايا بطانية اللمفاوية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حقول اللمفاوية والكبد، مثل كيفية استجابة الخلايا البطانية اللمفاوية، أو LECs، لمحفزات محددة وكيف تساهم في الإصابة بالأمراض. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا يمكن أن تقييم الكبد الكبد الخلايا البطانية الظاهرية والوظائف على أساس الخلية الواحدة، ويمكن استخدامها لتطبيقات أسفل تيار بعد فرز الخلايا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في علم الأحياء اللمفاوية في الكبد، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لتقييم الخلايا البطانية اللمفاوية من الأنسجة المختلفة، مثل الجلد والغدة الثديية.

(سيُظهر الإجراء أن (جيفري فينلون مساعد أبحاث محترف من مختبري لإعداد تعليق وحيد الخلية من خلايا الكبد المعزولة، تبدأ برش أسفل الماوس مع الإيثانول 70 في المئة، وتأمين الكفوف إلى لوحة تشريح. استخدام مقص تشريح لقطع الجلد حوالي سنتيمتر واحد فوق فتحة الشرج واستخدام ملقط مسنن لرفع الجلد بعيدا عن الجسم.

أدخل النصائح المقصية بين الجلد والصوانيم وافتح المقص لفصل الأنسجة قبل مواصلة شق الجلد حتى الرقبة. تأمين الجلد إلى لوحة التشريح تحت كل forelimb وفوق كل hindlimb، وسحب كيس البريتونية صعودا لتمديد شق نحو الرقبة. فهم فصوص الكبد وقطع فقط تحت القص للسماح تشريح حول الكبد.

ثم نقل الجهاز إلى أربعة ملليلتر من كليك في EHAA المتوسطة. استخدام مشرط لقطع الكبد إلى ما يقرب من قطعة قطرها ملليمتر واحد وهضم القطع في خمسمائة ميكرولترات من حل الهضم الطازجة وإعداد وخمسمائة ميكرولترات من DNase 1. بعد خمسة عشر دقيقة في سبع وثلاثين درجة مئوية، واستخدام الأنابيب 500 ملليلتر لخلط الأنسجة جيدا وإعادة الحاوية إلى الحاضنة لمدة خمس عشرة دقيقة أخرى.

في نهاية الحضانة، نقل العينة المهضوبة من خلال مصفاة مائة ميكرون في أنبوب مخروطي خمسين ملليلتر واستخدام المكبس من حقنة ملليلتر واحدة للضغط بلطف على القطع المتبقية من الأنسجة من خلال شبكة. اغسل الفلتر بخمس ملليلترات من عازلة العزل واضغط بلطف على أي أنسجة متبقية من خلال المصفاة. جمع خلايا الكبد المعزولة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في أربعة ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة.

بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وغسل الخلايا في عشرة ملليلتر من العازلة العزل وعد الخلايا على قياس الهيموسيت لتحديد عدد الكبد الكامل. إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من iodixanol 20 في المئة وتراكب تعليق الخلية مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. فصل الخلايا بواسطة كثافة فصل التدرج والحصاد طبقة بين برنامج تلفزيوني واليوديكسول.

ثم تصفية الخلايا من خلال مصفاة ميكرومتر مائة في أنبوب مخروطي جديد خمسين ملليلتر. غسل الخلايا في عشرة ملليلتر من العازلة العزلة الطازجة وإعادة تعليق بيليه الناتجة في خمسمائة microliters من برنامج تلفزيوني، وتستكمل مع مصل الأبقار الجنينية بنسبة 2 في المئة، أو FBS. بعد العد، aliquot ما يقرب من خمس مرات عشرة إلى الخلايا السادسة غير parenchymal في كل عنصر تحكم وبئر تجريبية من ستة وتسعين لوحة جيدا للطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في تسعين ميكرولترس من برنامج تلفزيوني زائد FBS في البئر.

أضف كوكتيلات الأجسام المضادة الأولية التجريبية والتحكم فيها إلى كل بئر وتلطيخ جميع الآبار مع علامة صلاحية مناسبة. الخطوة الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو المعايرة السليمة للأجسام المضادة واستخدام الضوابط نوع الجليد وضوابط fluorescence-1 للتحقق من تلطيخ. بعد ثلاثين دقيقة في أربع درجات مئوية، وغسل أجهزة الطرد المركزي الخلايا مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني زائد FBS في البئر ونقل الخلايا من كل بئر إلى الفردية خمسة ملليلتر تدفق أنبوب أنبوب cytometry جولة القاع إلى حجم نهائي 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني زائد FBS لكل أنبوب.

ثم، استخدام حجم صغير من الخلايا لضبط إعدادات الليزر والتعويض على جهاز قياس التدفق وقراءة كل الأحداث لكل أنبوب. عندما تم قراءة جميع الأنابيب، استيراد البيانات إلى تدفق تدفق مناسب تحليل برنامج. بوابة على الخلايا الحية على أساس صبغة علامة البقاء حيث يعتبر التعبير السلبي يعيش.

بوابة على الخلايا الحية على أساس حجم و حبيبية من الخلايا وكذلك على صلاحية علامة صبغ التعبير، تليها الغاء على CD45 السلبية CD31 السكان الخلايا الإيجابية باستخدام التحكم في ايزوتيبي المناسبة والبيانات fluorescence-1 لتحديد السكان الإيجابية والسلبية. ثم بوابة الخلايا السلبية CD31 CD31 السلبية وفقا لD16/32 والتعبير podoplanin للسماح بتحديد CD31 السلبية CD31، CD16/32 السلبية podoplaninجابية endothelial الليمفاوية، وDD45 سلبية CD31 إيجابية، CD16/32 إيجابية podoplanin الكبد السلبية الجيوب الأنفية السلمية مجموعات الخلايا البطانية. الخلايا البطانية مؤكدة التعبير عن الأوعية اللمفاوية والهالورونان البطانية واحد, ولكن ليس CD146.

الكبد المعزول CD31 إيجابية CD16/32 الخلايا الإيجابية المعزولة كما هو موضح هي أيضا CD146 إيجابية وpodoplanin إيجابية، في حين أن CD31 إيجابية CD16/32 الخلايا السلبية هي في المقام الأول CD146 سلبية وإما podoplanin إيجابية أو سلبية. تم تحديد الإيجابية على أساس تلطيخ الفلوريسين-1. خلايا البطاخيل اللمفاوية الكبد هي CD146 السلبية وPDPN إيجابية.

لا بطانة الأوعية الدموية ولا الضامة الكبد مورين التعبير عن podoplanin. يمكن أيضا أن تستخدم تلطيخ Podoplanin لتمييز cholangiocytes من الأوعية اللمفاوية على أساس الهياكل النووية المتميزة من القنوات الصفراوية وكذلك من قبل السيتوكيراتين 7 تلطيخ. كما الخلايا البطانية اللمفاوية فقط شارك في التعبير عن عامل النمو البطانية الوعائية مستقبلات 3 وبروسبيرو بروتين homeobox 1 في الكبد, ويمكن استخدام هذه العلامات كذلك لتأكيد نقاء الكبد فرز الخلايا البطانية اللمفاوية.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تعمل بسرعة والحفاظ على الخلايا على الجليد. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل فرز تدفق مجموعات LEC للإجابة على أسئلة إضافية، مثل التنميط النسخي لنصوص LECs. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا اللمفاوية الخاصة بالكبد لاستكشاف كيفية تأثير اللمفاويات على أمراض الكبد في الفئران والبشر.

عموما، سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال لأن الخلايا البطانية اللمفاوية هي نادرة، والسكان التدريجي في الكبد والطريقة التي تحتاج إلى أن يتم تنفيذها بسرعة.