قياس استقلاب الطاقة في اكسبلانتيد نسيج الشبكية باستخدام تحليل الجريان خارج الخلية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية مثل كيفية اختلاف استقلاب الطاقة في أنسجة الشبكية بين العينات البيولوجية، أو بعد التعرض لعوامل دوائية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم نسيج شبكية العين الأوغنتيبيكي المستزرع لقياس معدلات كل من تحلل الجلس، والفوسفور المؤكد ويسمح بتقييم التدخلات في الوقت الحقيقي في المختبر. لمعايرة الأجهزة لمقايسة تدفق خارج الخلية أولا إضافة ملليلتر واحد من محلول المعايرة إلى كل بئر من 24 خرطوشة استشعار جيدا، واحتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة مجانية Co2 بين عشية وضحاها.

تحميل إضافات لبروتوكول الإجهاد الميتوكوندريا، أو بروتوكول تحلل في كل منفذ حاقن على خرطوشة الاستشعار، والتكيف مع التغيرات في حجم في البئر. على افتراض حجم البئر الأولي من 450 ميكرولتر، فإن فحص نموذجي تشمل 45 ميكرولترات من مادة مضافة في ميناء الحقن الأول، 49.5 ميكرولتررس في للثانية، 54.5 ميكرولترات في الثالث، و 60 ميكرولترات في إلى آخر. خلال التجارب العديدة الأولى، تحميل قاعدة المتوسطة في ميناء A لقياس مقدار حركة الأنسجة يحدث قطعة أثرية بعد حقن الميناء.

اسمح للوحة الاستشعار المحملة بالاحتضان عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون لمدة 60 دقيقة على الأقل. بدء عزل أنسجة شبكية العين الماوس الطازجة مع فأر القتل الرحيم حديثا. استخدام زوج من ملقط المنحنية متوسطة الحجم لفهم الكرة الأرضية الخلفية في العصب البصري، وتطبيق الضغط إلى الأمام بلطف لدعم العين.

مع شفرة حلاقة نظيفة، إنشاء limbus إلى شق limbus عبر القرنية باستخدام تمريرة واحدة متعمدة من النصل. باستخدام ملقط نمط McPherson الزاوية الدقيقة ، قرصة الكرة الأرضية الخلفية للتعبير عن العدسة والأغشية الهالويد الأمامي للخروج من شق القرنية. كرر المناورة معسر مع ملقط للتعبير عن شبكية العين العصبية.

ثم، استخدم ملقط مثل ملعقة لرفع شبكية العين بعيدا عن شق القرنية. ضع الشبكية مباشرة في الوسط الدافئ في طبق من ثلاثة سنتيمترات ، أو ستة بئر النسيج ثقافة لوحة الكتلة. المقبل، واستخدام اثنين من أزواج من ملقط نمط ماكفيرسون الزاوية غرامة لتشريح بلطف الزجاجي المتبقية من شبكية العين.

ويتم ذلك على أفضل نحو من خلال استيعاب الزجاجي في محيط كأس الشبكية، وسحب نحو المركز، مع عدم إدراج النهائي للجسم الزجاجي من المركز ككل. ثم، إزالة أي ظهارة صبغ الشبكية المتبقية من سطح مستقبلات الصورة من شبكية العين. قطع طرف P1000 ماصة مع شفرة حلاقة لإنشاء فتحة حوالي أربعة ملليمتر لمنع صدمة لا مبرر لها في نسيج الشبكية الحساسة أثناء مناورات النقل.

ثم، استخدم طرف الماصات المقطوعة لنقل أنسجة الشبكية المعزولة إلى وسط جديد. وأخيراً، استخدم لكمة خزعة ملليمتر واحد مجهزة بمضرب، لقطع لكمات الشبكية حول العصب البصري. تعيين اللكمات الشبكية جانبا في وسط نظيفة، وأبقى على كتلة 37 درجة مئوية، أو وسادة التدفئة.

مرة واحدة وقد تم جمع العدد المطلوب من اللكمات، واستخدام لطيف P1000 تلميح لpirate لكمة الفردية في 450 ميكروليترس من المتوسط، ونقلها إلى 24 العين جيدا التقاط لوحة صغيرة على لوحة حرارة 37 درجة مئوية أو كتلة الحرارة. استخدام غرامة، ملقط مستقيمة لمعالجة بلطف اللكمات في وسط لوحة صغيرة. الحفاظ على اللكمات الموجهة في نفس الاتجاه.

على سبيل المثال، مع جانب الخلية العقدية صعودا. لكل تجربة جانبا ثلاثة إلى أربعة آبار فارغة مع 450 ميكرولترات من قاعدة المتوسطة لتكون بمثابة ضوابط سلبية. مع تجنب فقاعات الهواء أو الحركة المفرطة، ضع بلطف إدراج شبكة التقاط العين في كل بئر، وتأمين إدراج مع المكبس المعدنية أو مع قطع P1000 ماصة تلميح.

على الرغم من أن الغرفة الصغيرة لديها عمق كاف لاستيعاب شبكية العين الماوس نموذجية، أحيانا عيوب الجهاز في إدراج شبكة جعل الأنسجة تسبب تصبح مضغوطة بشكل مفرط أثناء الإدراج الشاشة. إذا حدث هذا، ببساطة جعل ملاحظة من هذا النسيج سحقت، واستبعاد تلك العينة من التحليل النهائي. احتضان لوحة الأنسجة في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل.

قم ببرمجة محلل تدفق الخلايا الإضافي باستخدام المزيج والوزن والتقييس وتكرار الأوامر. على سبيل المثال، قد تشمل تجربة نموذجية مع أنسجة شبكية العين ما يلي. اخلط دقيقتين، وانتظر دقيقتين، واتّهم خمس دقائق.

كرر التجربة مع هذه الخطوات الثلاث بين خمس إلى ثماني مرات لتسجيل خط الأساس، وبعد حقن كل مركب يجري اختباره. اضغط على زر بدء البرنامج على محلل تدفق خارج الخلية، واتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة لإدراج خرطوشة المستشعر للمعايرة. في نهاية المعايرة، اتبع التعليمات على الشاشة لاستبدال لوحة الفرجان مع لوحة تحتوي على عينات شبكية العينات، ثم السماح للبرنامج لتشغيل كما المبرمجة.

عند الانتهاء من المدى، اتبع التعليمات على الشاشة لإخراج لوحة الأنسجة. عرض نتائج تشغيل وتخزين ملف البيانات. مع إبرة قياس عازمة 20 ملقط، وإزالة جميع إدراج شبكة من الآبار، وترك لكمة شبكية العين وراء.

التعرق بعناية المتوسطة من الأنسجة، وغسل الأنسجة مرتين مع 0.5 ملليلتر من الفوسفات الباردة المالحة المخزنة. بعد التعرق غسل PBS الثاني ، إضافة 100 ميكرولترات من عازلة التحلل إلى كل غسل ، والماصات صعودا وهبوطا لتجانس الأنسجة. وأخيرا، كميات مستويات المدخلات على أساس إجمالي محتوى الحمض النووي مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل عن طريق تخفيف العينات lysed واحد إلى واحد، مع 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت تريس-EDTA، ونقل 100 ميكرولترات من العينة المخففة إلى 96 لوحة بئر.

ثم، إضافة 100 ميكرولترات من الكشف عن العازلة إلى كل بئر ويخلط لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. وأخيرا، الفلوريسات الكميات بعد الإثارة في 480 نانومتر والانبعاثات في 520 نانومتر من خلال مقارنة منحنى قياسي. تطبيع تدفق خارج الخلية الخام لتتبع محتوى الحمض النووي داخل البئر.

في خط الأساس، في وجود خمسة ملليمتر مولر الجلوكوز وفي وجود 10 ملليمتر مولر بيروفات، لا يوجد فرق كبير في معدلات حمض eflux، تقاس بمعدل التحمض خارج الخلية. بين أنسجة الشبكية من أنواع الحيوانات فيل، أو ضرب الفئران التي تفتقر إلى الآلات لإغلاق القنوات الأيونية المسورة دوري النويكليوتي استجابة للمحفزات الخفيفة. وينظر إلى أنماط مماثلة بعد إضافة 20 ملليمتر مولر الجلوكوز ومثبط جليكوليك 2DG.

وقد تتحول هذه البيانات رياضياً لتمثل تغييرات كسرية عن خط الأساس، وهو شكل قد يسمح بإجراء مقارنة أفضل بين التدخلات التجريبية المختلفة. معدل استهلاك الأكسجين المطلق عند خط الأساس هو أيضا ما يعادل بين السيطرة والأنسجة الشبكية متحولة. إضافة 20 ملليمتر مولر الجلوكوز يزيد من التنفس الميتوكوندريا, ولكن لا يوجد أي تغيير في لوحظ بين المجموعات من حيث القياس الكمي المطلق أو من حيث التغيير من خط الأساس.

إضافة واحدة من الملي مولر FCCP، وهو عامل فك الارتباط، لإثبات معدلات التنفس الميتوكوندريا القصوى لا يزيد بشكل كبير OCR فوق المستوى الذي شوهد مع ارتفاع الجلوكوز في السيطرة والأنسجة الشبكية متحولة. ومع ذلك ، فإن الإشارات من كلا الفئران تنخفض بشكل كبير بعد إضافة كوكتيل RAA. في الختام، ونحن نبرهن على تقنية لمعدلات كمية من الفوسفور المؤكد وتحلل في explants organotypic من شبكية العين الماوس.

مع العزلة الفعالة للأنسجة الشبكية، تعطي هذه التقنية قياسات موثوقة وقابلة للرخوة. ويمكن تقييم الآثار الفعلية للتعرض، مثل عوامل فك الارتباط. بالإضافة إلى هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل رتبمير كمي ونشاف الغربية، على فائض الأنسجة المعزولة في خطوة التشريح للحصول على معلومات موازية ذات صلة بدراسات التمثيل الغذائي الشبكي.