تجميد سطح الوظيفية للجينات باستخدام الطباعة الحجرية التشرد حبلا متعددة الخطوات

الدنا biochips هي منصة بحثية جذابة للبيولوجيا الذاتي إعادة التركيبية، وضعت أصلا من قبل مجموعة BASF، والذي يسمح لتشغيل الدوائر الجينية في المختبر على مدى فترات طويلة من الزمن. ومن خلال هذا البروتوكول، نأمل أن نجعل هذه التكنولوجيا متاحة لمجموعة أوسع من الباحثين. وتمثل طريقتنا، التي يطلق عليها "الطباعة الحجرية" "Bephore"، استراتيجية لشل حركة الحمض النووي استناداً إلى تفاعل إزاحة حبلا الحمض النووي.

تكمن قوة هذه التقنية في قدراتها الحجرية متعددة الخطوات ، وقابلية تكرارها البسيطة ، والتوافر التجاري لجميع المكونات. على غرار حلول التراكم الأحيائي الأخرى، يمكن الجمع بين البيفور والتكنولوجيات المختلفة. على سبيل المثال، يمكن تجميع فرش الجينات الوظيفية داخل مقصورات صغيرة للتعبير البروتيني.

للبدء، إعداد خليط RCA عن طريق خلط خمسة أجزاء من الماء مع جزء واحد من محلول الأمونيا 30٪ في كوب زجاجي. سخني الخليط إلى 70 درجة مئوية على طبق ساخن أثناء التحريك. بمجرد أن تصل إلى 70 درجة مئوية، إضافة جزء واحد 30٪ بيروكسيد الهيدروجين.

ثم ضع رقاقة سيليكون قطرها 100 ملليمتر في المحلل ، لإزالة المواد العضوية والجسيمات منه. بعد 30 دقيقة ، أخرج الركيزة ، اشطفها جيدًا بالماء من زجاجة غسيل ، وجففها ببندقية النيتروجين. المضي قدما على الفور مع PEGylation الركيزة.

لتحقيق ذلك، أولا تخفيف البيوتين-PEG-سيلان في toluene الجافة إلى 5 ملليغرام لكل ملليلتر، ودوامة الحل حتى يتم خلطها بشكل جيد. مع الركيزة وضعت في طبق بيتري الزجاج، ماصة ببطء الحل على الركيزة، وتغطي السطح كله، ولكن تجنب السماح للمحلول بالتدفق على الحافة. بمجرد تغطية السطح، أغلق طبق بيتري، ثم أضف غطاء إضافي.

بعد 30 دقيقة، وإزالة الغطاء، وإضافة ما يقرب من 40 ملليلتر من الكحول الأيزوبروبيل إلى طبق بيتري. ثم أخرج الركيزة، شطف مرة أخرى تماما مع الكحول ايزوبروبيل، وتجفيفه مع بندقية النيتروجين. عندما تجف، تخزين الركيزة في الظلام حتى الحاجة إليها.

إعداد الركيزة باستخدام قاطع الزجاج أو مشرط لتشكيل سنتيمتر واحد في قطعة سنتيمتر واحد. ثم، إضافة علامة محاذاة بسيطة عن طريق جعل الصفر قصيرة من المركز نحو حافة الركيزة. انفخ أي جزيئات صغيرة من الرقاقة باستخدام مسدس النيتروجين.

بعد ذلك، اخلطي قطرتين من غراء سيليكون مكونين، وطبق الغراء على سطح الشريحة، تاركا المنطقة المحيطة بطرف الخدش فارغا. هناك الغراء يوفر حاجز رهاب الماء، والحفاظ على حلول مائي على رقاقة. وهذا يسهل خطوات الغسيل اللاحقة، ويقلل من كمية الحمض النووي المطلوبة للحضانات.

في خطوة لاحقة، يمكن بسهولة مقشر الغراء قبالة. في الخطوات التالية، يتم التعامل مع الحمض النووي القابل للضوء فقط في بيئة الضوء الأصفر. غطي الرقاقة بنحو 10 ميكرولترات من خليط bephore في درجة حرارة الغرفة، ووضع الشريحة في مربع مملوءة جزئيا بالماء للحد من التبخر.

بعد ساعة واحدة، وغسل رقاقة عدة مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي مزيج غير منضم bephore. بعد ذلك، أضف 10 ميكروليترات من مزيج التخميل إلى الشريحة. بعد ساعتين، قم بغسل الشريحة عدة مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة عوامل التخميل غير المنضمة.

قص قناع صورة مطبوعة إلى الحجم المناسب من أجل احتواء حامل قناع مناسب. إدراجه في موضع توقف الحقل، واستخدام علامات المحاذاة لمحاذاة القناع في الحامل. مع الركيزة وضعت على مرحلة المجهر، إدراج مرشح أحمر في مسار الإضاءة، والتركيز على سطح الركيزة.

ثم انتقل إلى منطقة الركيزة التي سيتم كشفها. بعد ذلك، أدخل حامل القناع، ومنع الإضاءة، وتغيير إلى مرشح الأشعة فوق البنفسجية. في شدة الإضاءة المنخفضة، افتح الغالق واستخدم الكاميرا للتركيز بسرعة على القناع على الركيزة.

مع الركيزة الانحياز الآن والقناع في التركيز، ومنع مسار الضوء إلى الكاميرا، وإضاءة الركيزة في شدة الضوء عالية لوقت التعرض المطلوب. بعد التعرض، وإزالة العينة من المجهر، وإزالة بعناية أكبر قدر ممكن من العازلة من الركيزة دون تجفيفه. ثم، إضافة 10 إلى 20 ميكرولترات من الحمض النووي مع تسلسل للتعلق إلى السطح.

ضع الركيزة في صندوق رطب لمنعه من التجفيف ، واحتضان الحمض النووي على الركيزة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. من أجل مراقبة التعبير الجيني المجزأ على مجهر مقلوب ، أولاً إعداد بشكل منفصل جزأين من حامل العينة. ابدأ بلصق شريحة من الـ bephore بفرشاة جين معطلة على حامل الشريحة، باستخدام شريط لاصق مزدوج الوجهين.

بعد ذلك، إضافة بعض الشحوم حول فراغ ثقب المركزية من الجزء السفلي من حامل، وإدراج حامل رقاقة. الآن تجميع الجزء العلوي من حامل. قطع رقاقة PDMS رقيقة مع مقصورات صغيرة قدر الإمكان، وترك قناة مفتوحة إلى جانب واحد للسماح في وقت لاحق لتبادل النفايات والجزيئات السلائف عن طريق نشر التالي، البلازما علاج زلة غطاء زجاجي في الجانب الخلفي من رقاقة PDMS مع بلازما الأكسجين.

بعد العلاج مباشرة، ضع شريحة PDMS في وسط الشريحة الزجاجية، مع توجيه المقصورات لأعلى. ثم، خبز الزجاج مع PDMS لمدة ساعة واحدة في 70 درجة مئوية. قبل وقت قصير من تجميع حامل العينة بأكملها، البلازما علاج الشريحة الزجاجية مع رقاقة PDMS كما كان من قبل.

ثم، إضافة بعض الشحوم فراغ حول ثقب كبير من حامل أعلى، ووضع الشريحة الزجاجية مع PDMS على ذلك. اضغط بلطف على الزجاج على الشحوم. إزالة المخزن المؤقت بعناية من رقاقة، وغسلها مرة واحدة مع 10 ميكرولترات من نظام إعادة التعبير الذاتي.

بعد ذلك، إضافة 60 ميكرولترات من نظام إعادة التعبير الذاتي على رقاقة، وإزالة الغراء سيليكون مكونين من الحواف. الآن، إضافة 20 ميكرولترات من نظام التعبير إلى PDMS. بعد وضع القطرة على PDMS ، تحقق بسرعة في المجهر المجسم أن المقصورات رطبة بشكل جيد وبدون فقاعات الهواء.

إذا كان هناك فقاعات الهواء، في محاولة لغسلها بعيدا. لتجميع قطعتين من حامل، ومحاذاة الغرف وفرش الحمض النووي، والعمل تحت المجهر مجسمة. قم بشل حامل القاع بذراع ممسكة بحيث يمكن الوصول بسهولة إلى المسمارين والجناحين بكلتا يديه.

إدراج حامل أعلى في حامل أسفل، وخفضه حتى الخلايا خالية من نظام التعبير الصمامات. ثم تحقق للتأكد من أن المقصورات وعلامة المحاذاة في منطقة مشابهة في مستوى XY. من أسفل، المسمار حتى wingnuts حتى أنها تلمس الجانب السفلي من حامل.

أثناء محاذاة المقصورات والرقاقة في الطائرة XY، قم بتشدّد الجناحين برفق. هذه الخطوة تتطلب بعض الخبرة، ويعتمد على بناء حامل العينة. يجب الضغط على PDMS على الشريحة فقط بقوة لطيفة.

بعد ذلك، رش إسفنجة في حاوية مضادة للتبخر بالماء، وأدخل الحامل في الصندوق. ثم، ملء حقنة خمسة ملليلتر مع اثنين من مكونات السيليكون الغراء، واستخدامها لختم مربع. وأخيرا، نقل مربع إلى مجهر درجة الحرارة التي تسيطر عليها، وصورة فرشاة الحمض النووي والتفاعل باستخدام المجهر الفلوريس.

عملية حجرية من خطوتين، يتم تنفيذها هنا على شريحة زجاجية من نوع bephore، تسفر عن أنماط متداخلة من خيوط الحمض النووي المسمى الفلورسنت. في هذه المظاهرة للتعبير الجيني على رقاقة، يتم شل الحمض النووي في الغرفة على اليسار. عندما يتعرض لمزيج التعبير، يتم تصنيع البروتين الفلورسنت الأصفر YPet من الحمض النووي غير المُشلَّل.

لتقييم نشاط نظام التعبير الجيني ، يلاحظ استرداد الفلوريس بعد خطوة التبييض. في ساعتين، تعافت شدة الفلوريسنسي بسرعة. ومع ذلك، بعد أربع وست ساعات، فإنه لم يتعافى، مشيرا إلى أنه من دون إمدادات جديدة من مزيج التعبير، توقف التفاعل حول ساعة أربعة.

وعلى الرغم من أن التعبير الجيني محدود في نظام مغلق، إلا أنه يمكن الحفاظ عليه على مدى فترات زمنية أطول من خلال تزويد مقصورات التعبير بجزيئات السلائف الإضافية عن طريق السوائل الدقيقة. طريقة bephore يستخدم لشل oligonucleotides أو الحمض النووي طول الجينات، والتي يمكن تطبيقها لبناء نظم من فرش الحمض النووي التفاعل للتعبير الذاتي إعادة الجينات. ويمكن أيضا استخدام هذه التقنية لتطبيقات أخرى في الفيزياء الحيوية، مثل دراسات الفلور الجزيء المفرد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرة على تصنيع البيوت bephore من رقائق أو الشرائح الزجاجية، ودمجها في مشاريع البحوث الخاصة بك.