البروتيوميات من أعلى إلى أسفل على نطاق واسع باستخدام المنطقة الشعرية التفريد جنبا إلى جنب الكتلي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحسين توصيفات عالية النطاق وعالية الدقة للبروتين isoforms والتعديلات اللاحقة للبروتين في الخلايا. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن منطقة الشعيرات الدموية الكهربائي الطيفي الشامل يوفر فصل عالية الكفاءة والكشف الحساسة للغاية من البروتينات سليمة. لعلاج ما قبل الشعرية، جففه بغاز النيتروجين عند 10 بوصة مربعة لمدة 12 ساعة على الأقل.

ثم، ملء شعري مع 50٪ حجم من قبل حجم 3-بروبيل الميثاكريلات في الميثانول باستخدام مضخة حقنة. ختم طرفي شعري مع المطاط السيليكا. بعد احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة على الأقل، والاستمرار مع طلاء بوليكريلاميد خطي على الجدار الداخلي من الشعرية الفصل، كما هو موضح في بروتوكول النص.

حرق جزء من شعري باستخدام لهب لطيف لإزالة الطلاء الخارجي بوليميد حوالي أربعة سنتيمترات بعيدا عن نهاية واحدة من الشعرية. تنظيف بلطف الجزء المحروق من الشعرية عن طريق مسح لإزالة طلاء البولي أميد تماما. حفر حفرة صغيرة في نهاية أنبوب 200 ميكرولتر حول نفس حجم القطر الخارجي الشعري لعقد ما يكفي من الشعيرات الدموية في مكان بمجرد أن يتم الخيوط من خلال هذا الثقب.

خيط نهاية الشعرية التي هي قريبة من الجزء المحترق من خلال ثقب حتى الجزء المحترق هو في الأنبوب. ثم، إضافة ما يقرب من 150 ميكرولترات من التردد العالي إلى أنبوب 200 ميكرولتر بحيث حل HF هو حوالي منتصف الطريق حتى الجزء المحترق على شعري. احتضان الشعيرات الدموية في محلول HF في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 إلى 100 دقيقة.

إعداد مزيج البروتين القياسي وعينة الإشريكية القولونية كما هو موضح في بروتوكول النص. لإعداد منطقة الشعيرات الدموية الكهربائية، أو نظام CZE، تحميل العينة، والكهرباء الخلفية، والشعيرات الدموية في CZE العينات التلقائي. حدد نموذج التحميل في صفحة التحكم اليدوي من العينات CZE التلقائي.

قم بتحميل قارورة الإلكتروليت الخلفية في علبة المخزن المؤقت لعينات السيارات، مع الإشارة إلى موضعها في حاوية المخزن المؤقت. ثم، قم بتحميل قارورة العينة في علبة العينة العينة التلقائية، مع الإشارة إلى موضعها في علبة العينة. ضع العينات التلقائية إلى موضع المحاذاة باستخدام التحكم اليدوي.

الآن، تحميل الشعرية فصل في CZE لصناعة السيارات العينات باستخدام نهاية غير محفورة من الشعرية. ضبط ارتفاع نهاية حقن الشعرية إذا كان حجم العينة أقل من 50 ميكرولترات. قم بتبديل العينات التلقائية إلى وضع الاستعداد باستخدام التحكم اليدوي.

اكتب موضع العينة في النظام ثم حرك الشعيرات الدموية إلى العينة. دفع نهاية حقن الشعرية مزيد من أسفل للوصول إلى الجزء السفلي من القارورة عينة. الاستمرار في استخدام التحكم اليدوي، مسح شعري مع المنحل بالكهرباء الخلفية لمدة 20 دقيقة باستخدام ضغط 20 psi.

الآن، جبل تجاري كهربائي ضخ واجهة تدفق اغنم إلى الجزء الأمامي من مطياف الكتلة. ملء خزان العازلة مع العجم مع العازلة التي تحتوي على 10٪ حجم حجم الميثانول و 0.2٪ حجم حجم حمض فورميك في المياه LCMS الصف. تدفق T في واجهة مع العازلة مع اغدغة عن طريق الضغط عن طريق الضغط يدويا مع حقنة.

خيط الطرف الخارجي قطر واحد ملليمتر من باعث اكزبر من خلال أنابيب الأكمام وتوصيل الباعث بمنفذ واحد من T عبر تركيب. ببساطة تدفق T يدويا مرة أخرى مع حقنة لملء باعث مع العازلة اغرد. ضبط المسافة بين فتحة الباعث ومدخل مطياف الكتلة إلى ما يقرب من مليمترين بمساعدة الكاميرا التي تأتي مع الواجهة.

تطبيق جهد 2-2.2 كيلوفولت في قارورة العازلة الزدة للرذاذ الكهربائي. ثم، ضبط الجهد رذاذ للوصول إلى رذاذ كهربائي مستقر. تطبيق ضغط منخفض في نهاية حقن الشعرية خلال هذه العملية للتأكد من عدم وجود فقاعات في الشعيرات الدموية.

إيقاف الجهد رذاذ وخيط بلطف نهاية محفورة من الشعرية فصل من خلال T في باعث حتى لا يمكن دفعها أكثر من ذلك. بعد وقف الضغط المنخفض في نهاية حقن الشعرية، تدفق باعث قليلا مع عازلة اغددار. مرة أخرى، تطبيق اثنين إلى 2.2 كيلوفولت من رذاذ الجهد لاختبار رذاذ.

حدد طريقة جديدة تحت القائمة المنسدلة ملف على الشاشة الصك الرئيسي. هناك، حدد مدخل كقارورة عينة البداية، وإنهاء قارورة عينة، صينية كعينة، والضغط على النحو خمسة psi، كيلوفولتس كما صفر، ومدة 95 ثانية لحقن العينة. ثم، تعيين مدخل كما قارورة مدخل، علبة كما العازلة، والضغط كما psi صفر، كيلوفولت 30، ومدة 4، 200 ثانية لفصل عينة بروتينية القياسية.

لفصل عينة البروتيوم الإشريكية القولونية، تعيين مدخل قارورة مدخل، صينية كما العازلة، والضغط كما صفر PSI، كيلوفولتس 20، ومدة 6، 600 ثانية. وأخيرا، حدد مدخل قارورة مدخل، علبة كما العازلة، والضغط كما 10 psi، كيلوفولتس ك 30، ومدة 600 ثانية لالرمشاط الشعرية. الآن، إعداد المعلمات MS وMS / MS لتحليل البروتين سليمة باستخدام مطياف قناع فخ ايون رباعية.

لضبط إعدادات ملف التناغم، قم بتشغيل وضع البروتين السليم واستخدم ضغط تعويض اللون 0.2. تعيين درجة حرارة الشعيرات الدموية نقل أيون إلى 320 درجة مئوية ومستوى الترددات اللاسلكية S-عدسة إلى 55. لتنفيذ تجربة MS/MS CZE، ابدأ تشغيل أسلوب الحصول على البيانات على جهاز الكمبيوتر الطيفي الشامل، أولاً بتحديد تسلسل التشغيل.

ثم، بدء تسلسل الكهربائي الشعرية على الكمبيوتر الكهربائي الشعرية العينات التلقائي. إجراء بحث في قاعدة بيانات باستخدام TopPIC في مجموعة TopPIC وفي واجهة المستخدم الرسومية TopPIC. انقر فوق ملف قاعدة البيانات وحدد قاعدة بيانات مناسبة للبحث.

انقر على ملف الطيف وحدد ms2 ولدت. msalign الملف الذي تم إنشاؤه كمدخل. حدد ملف ميزة MS1 واختر ملف الميزة التي تم إنشاؤها.

تعيين السيستين كارباميدوميثيل C57 كتعديلات ثابتة بسبب علاج iodoacetamide. حدد ميزة قاعدة بيانات الخداع وتحت إعدادات القطع، حدد معدل اكتشاف زائف في القائمة المنسدلة بجوار مستوى الطيف. تعيين معدل الاكتشاف الخاطئ إلى 0.01 على مستوى الطيف.

ترك وظيفة توليد غير محددة وتعيين التسامح مع الخطأ إلى 15 أجزاء في المليون. تعيين معدل اكتشاف كاذبة إلى 0.05 على مستوى البروتيفورم. ضمن المعلمات المتقدمة، حدد اثنين للعدد الأقصى من التحولات الجماعية في القائمة المنسدلة.

تعيين الحد الأقصى للتحول الشامل من تعديلات غير معروف إلى 500 daltons. اترك كافة المعلمات الأخرى بقيمها الافتراضية وانقر فوق زر البدء في أسفل يمين واجهة المستخدم الرسومية. يظهر المخطط الكهربائي التمثيلي لخليط البروتين القياسي.

وعادة ما يتم تشغيل مزيج البروتين القياسي على الأقل في مكررة لتقييم كفاءة الفصل وإعادة إنتاج النظام. ويمكن تقييم كفاءة الفصل مع عدد من لوحات نظرية من بعض البروتينات. ويمكن تقييم قابلية التكاثر من خلال الانحرافات المعيارية النسبية لكثافة البروتين ووقت الهجرة.

يمكن استخدام منصة CZE MS/MS لتوصيف البروتيوفورم على نطاق واسع في مختلف البروتيومات المعقدة ، وتحديد أكثر من 500 بروتيوفورم و 190 بروتين من بروتين الإشريكية القولونية في شوط واحد بثقة عالية. هنا، يمكن استخدام التكبير في ضوء electropherogram لتقييم نافذة الفصل للنظام. القيمة الإلكترونية المنخفضة جداً وFDR الطيفية تشير إلى الثقة العالية من ID.The proteoform ID.The ارتفاع عدد الأجزاء المتطابقة يشير كذلك إلى الثقة العالية من ID.While محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن الخيط الشعري الفصل المحفورة في باعث رذاذ كهربائي ببطء وبلطف.

يمكن دمج وضع العلامات النظيرية المستقرة أو الأساليب الخالية من التسميات في إجراء CZE MS لتحديد كيفية تغير الوفرة البروتيفورمية في الخلايا عبر ظروف مختلفة. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البروتيوميات من أعلى إلى أسفل لاستكشاف أدوار البروتيفورمات في تنظيم العمليات البيولوجية المختلفة في الخلايا. لا ننسى أن العمل مع حمض الهيدروفلوريك يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل معدات الحماية الشخصية المناسبة وجود إجراءات الطوارئ في مكان دائما عند تنفيذ هذا الإجراء.