دسرنا استنساخه Microinjection و "الحشري أوفيبوسيتيون" في البعوض والذباب البيت

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المبيدات الحيوية ، مثل كيفية تأثير التعبير الجيني للخيط المزدوج RNA ، و fecundity في dipterans البالغين. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الجرعات القابلة للقياس الكمي من الخيط المزدوج يتم تسليمها إلى البعوض أو الذباب، ويمكن بعد ذلك تقييم التأثير الناتج على الفتك متعدد الأجيال. على الرغم من أن يتم تقديم هذه الطريقة للبعوضة ، aedes aegypti ، ويطير المنزل ، musca المحلي ، يمكن تطبيقه أيضًا على أنواع أخرى من البعوض والذباب.

عموما, سوف الأفراد جديدة لهذه الطريقة النضال, لأن اتقان إجراء الحقن نفسه هو استثمار الوقت. حقن كل حشرة مع حجم تلميح إبرة الأمثل أمر بالغ الأهمية لضمان الولادة مع تقليل الإصابات والوفيات. للبدء ، استخدم ملقطًا لمرحلة البعوض بعناية بحيث يتم كشفها في نهاية المطاف على شريحة مجهرية تفصلها نصف سنتيمتر تقريبًا.

للمساعدة في معالجة الشريحة، اترك مسافة واحدة إلى نصف سنتيمتر في الطرف الأيسر أو الأيمن من الشريحة. ثم ضع شريحة الحشرات المرحلية عند أربع درجات مئوية في طبق بتري كبير. إعداد مجهر تشريح وناجين microinjector على طاولة البرد.

بعد سحب الشعيرات الدموية الزجاجية إلى طرف غرامة، ضع إبرة شعرية في الحقن المجهري وكسر طرف إبرة مع ملقط. ثم شطف الإبرة عن طريق رسم وطرد النوى المياه الحرة ثلاث مرات. لاحظ أن أحجام فتح الإبرة الزجاجية تختلف بين البعوض وذباب المنزل.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول حقن مع تركيز مناسب للبعوض. إضافة ثلاثة ميكروغرام لكل ملليلتر من رودامين B إلى الحل للمساعدة في التصور. استخدام ماصة لنقل ثلاثة إلى أربعة ميكرولترات من الحل إلى سطح نظيف، واسحبه إلى إبرة زجاجية دون أخذ في أي الهواء.

اِكتِل زر الحقن مراراً وتكراراً حتى يبدأ السائل في الاستغناء عن الإبرة. استخدام علامة نقطة فائقة غرامة لرسم علامات التجزئة حوالي ملليمتر واحد وبصرف النظر، بدءا من الغضروف المفصلي السائل إلى ساق إبرة. تعيين شريحة البعوض تحت الإبرة والتأكد من أن مجال الرؤية واسعة بما يكفي لرؤية الغضروف المفصلي حل في الإبرة.

محاذاة الإبرة مع الثلث الأوسط من عظم القص mesocarape. قم بتكليس البعوضة ضد الإبرة مع ملقط يوضع على الجانب الآخر للبعوضة ، وثقب بشرة بلطف مع طرف الإبرة. مرر الإبرة بلطف إلى البعوض حتى تمر التلميح عبر خط الوسط.

قم بالاكتئاب على زر الحقن حتى يتم حقن الكمية المطلوبة من السائل. إذا لم يتحرك الغضروف المفصلي ، فانزلق البعوض ببطء أو يطير من الإبرة أثناء مشاهدة حركة الغضروف المفصلي. إذا كان جزء من حبات الحل المحقونة من بشرة عند إزالة إبرة، أو إذا فشل الغضروف المفصلي في التحرك، تخلص من الحشرة لأن الحقن لم يكن ناجحًا.

على ذبابة المنزل، محاذاة الإبرة مع mesopleuron. قم بتكليس الذبابة ضد الإبرة مع وضع ملقط على الجانب الآخر للذبابة ، وثقب بشرة بلطف مع طرف الإبرة. نقل الحشرات المحقونة إلى مسح 3.5 أونصة عقد أكواب في مجموعات من عشرة إلى 15.

ثم تغطية الكأس مع المعاوضة، والسماح لهم لاسترداد في درجة حرارة الغرفة. بعد أن تعافى الحشرات ، عكس الكأس القابضة على كرة قطنية غارقة في محلول السكروز بنسبة 10٪. أولا، ملء غشاء اصطناعي 12 بوصة مع الدم الطازج، وتسخينه إلى 60 درجة مئوية في حمام الماء الساخن.

جفف الغشاء بمنشفة ورقية، ووضعها عبر غطاء المعاوضة للكأس القابضة. بعد تغذية البعوض ، استبدل كرة القطن وتسمح للبعوض بالراحة لمدة 24 ساعة. المقبل، وبناء أكواب oviposition عن طريق ملء واضحة 3.5 أوقية الأكواب خلات الحيوية مع ما يقرب من 30 ملليمتر من المياه الأيونية.

ثم ضع قطعة من بذور الإنبات ورقة في الجزء السفلي من الكأس. تغطية الكأس مع المعاوضة، وقطع شق صغير في قبعة المعاوضة. بعد 24 ساعة من التغذية، وقطع شق صغير في قبعة الكأس عقد ونقل الإناث التي تغذي بنجاح إلى أكواب oviposition.

ثم ختم الشق الصغير في غشاء oviposition مع 10٪ سكروز الكرة القطن المشبعة. مراقبة البعوض، وتتبع الوفيات اليومية. بعد السماح للبعوض ببويضة لمدة خمسة إلى سبعة أيام ، عد البيض تحت مجهر تشريح.

وسوف يكون إثبات الإجراء الدكتور كريستوفر غيدن، وهو طبيب الحشرات البحوث وزارة الزراعة الأميركية ARS. بعد ثلاثة أيام من الحقن، يُقَدّن الذباب بثاني أكسيد الكربون. ثم نقل الذباب إلى قفص نظيف مع الماء وإعداد النظام الغذائي يطير.

تسجيل بيانات الوفيات، وإزالة الذباب الميت يوميا. المقبل، مزيج 75٪ نخالة القمح مع 25٪ بيليه تغذية الأسهم الحية حسب الوزن لإعداد وسيط تربية اليرقات. يضاف الماء إلى الخليط حتى يتم تحقيق 62٪ الرطوبة.

أضف خليط تغذية الأعلاف الحية لنخالة القمح المبلل إلى مربع من القماش الأسود، ونلفه إلى كرة. استخدام شريط مطاطي للحفاظ على القماش في مكان، والضغط بلطف حتى يتسرب المتوسطة السائلة من خلال. ضع الكرة في كوب 60 ملليلتر، ووضعها في قفص الذبابة لمدة خمس ساعات.

بعد ذلك ، شطف البيض من الكرة ، وضمان إزالة البيض من تحت طيات القماش. هز البيض لتعطيل أي مجموعات، ونقلها إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 20 ملليلتر تخرج. السماح للبيض لتسوية، وملاحظة حجم استقر البيض في الأنبوب.

ثم إضافة ما يكفي من الماء لتحقيق حجم إلى 20 مرة حجم البيض استقر. بعد ذلك، استخدمي شريطًا مغناطيسيًا لخلط الماء وتعليق البيض. وأخيراً، استخدمي طرف ماصة معدلة للاستغناء عن 0.5 ملليلتر من التعليق على قطعة من القماش الأسود المبطر مسبقاً في سلسلة من الخطوط.

في هذا البروتوكول، تم حقن البعوض الإناث الجزئي لتقييم التعبير الجيني. وأظهرت حقن الإناث مع حبلا مزدوج الحمض النووي الريبي انخفاض كبير في التعبير النسبي عبر دورات متعددة oviposition. تم تخفيض متوسط أحجام القابض في البعوض في الدورة الغنطية الأولى بشكل كبير لكل من مجموعات dsRPS6 و dsRPL26 المعالجة.

ولوحظ تأثير جرعة واضحة في أحجام مخلب عند حقن dsRPS6 من ميكروغرام واحد إلى 50 نانوغرام في البعوض الإناث. كما تم حقن ذباب المنزل بخمسة ميكروجرامات من شيد الحمض النووي الريبي المزدوج. وعلى غرار ملاحظات البعوض، لوحظ انخفاض كبير في كل من التعبير المحددة وحجم القابض.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التخلص من الحشرات التي لم يتم حقنها بنجاح. باستخدام هذا الإجراء، يمكن تسليم أي خيط مزدوج من RNA أو أي نوع بيولوجي آخر للبعوض أو الذباب. لا ننسى أن العمل مع الإبر الزجاج يمكن أن تكون خطرة، وأنها ينبغي دائما أن يتم التخلص منها في حاويات النفايات الحادة المناسبة.