باراميكسوفيروسيس لاستهداف الورم المرباة: التصميم والتقييم السابقين فيفو

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في مواجهة التحديات الرئيسية في مجال العلاج المناعي للسرطان من خلال تسهيل تطوير ناقلات على الكوتوليك من أجل التعديل المناعي المستهدف. الميزة الرئيسية للنظام الوراثي العكسي المطبق هي تعدده؛ وبالتالي، يمكن تكييف النواقل لمعالجة مختلف الأسئلة البحثية واستهداف الأورام ذات التوقيعات المناعية المتنوعة. خطوات انتشار الفيروس تحديد خصوصا نقطة الوقت الأمثل لحصاد الفيروس من الصعب تعلم من بروتوكول النص لأن تشكيل syncytia يجب أن يتم تقييم بصريا مع مرور الوقت.

البدء في تصميم ونسخ ناقلات مناعية المؤتلف كما هو موضح في المخطوطة. يصف هذا البروتوكول خطوات محددة لتطوير ناقل لقاح الحصبة على الكولليك، وترميز خلية تي بيسيفيك. لإنقاذ فيروس الحصبة من cDNA، قبل 24 ساعة من خلايا منتج فيروس الحصبة في صفيحة الحصبة بألواح الحمل بالتساوي على لوحة جدارية 6.

بذور 200، 000 الخلايا في 2 ملليلتر DMEM تحتوي على 10 في المئة FBS في البئر لتحقيق 65 إلى 75 في المئة التقاء في وقت transfection. مزيج 5 ميكروغرام من الحمض النووي المؤتلف ترميز antigenome فيروس الحصبة التي سيتم استخدامها لtransfect الخلايا. plasmids المناسبة ومراسل الفلورسنت في حجم إجمالي قدره 200 ميكرولترات من DMEM.

إضافة 18.6 ميكرولترات من كاشف نقل الدهون إلى الخليط ونفض الغبار على الفور الأنبوب لخلط. احتضان هذا المزيج transfection لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لنقل الخلايا المنتجة MV إزالة المتوسطة من لوحة 6 جيدا نمت إلى 65 إلى 75 في المئة التقاء وإضافة 1.8 ملليلتر من DMEM مع 2 في المئة FBS و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر Kanamycin في البئر.

ثم إضافة المزيج القطرة transfection إلى كل بئر ودوامة بعناية. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي استبدال المتوسطة مع 2 ملليلتر من DMEM الطازجة مع 2 في المئة FBS و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر Kanamycin وكرر هذا عندما يصبح المتوسطة الحمضية المعترف بها من قبل اللون الأصفر.

استخدام المجهر لمراقبة الخلايا يوميا للتعبير الجيني مراسل وتشكيل syncytia. عندما تكون syncytia كبيرة تتكون من 20 أو أكثر من الخلايا مرئية أو عندما تصبح الخلايا كثيفة جدا حصاد الفيروس. قبل 24 ساعة من بذور الحصاد المتوقعة ما يقرب من 1.5 مليون خلية منتجة MV في 12 ملليلتر من DMEM مع 10 في المئة FBS على أطباق 10 سنتيمتر لتحقيق 65 إلى 75 في المئة التقاء في وقت تلقيح الفيروس.

لجمع progyny الفيروس استخدام مكشطة الخلية لتكشط بعناية الخلايا المنتجة الملتزمة من لوحة جدار 6 مع الخلايا المصابة. نقل الوسيطة التي تحتوي على الخلايا المكشطة إلى أنبوب طرد مركزي. أجهزة الطرد المركزي على الأقل 2500 مرة G و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لإزالة حطام الخلية.

بعد الطرد المركزي مزيج من الخلايا الخالية من كبرى مع مصل حر المتوسطة إلى حجم النهائي من 4 ملليلتر لإعداد inoculum. إزالة المتوسطة من طبق 10 سم مع خلايا المنتج MV وإضافة inoculum إلى الخلايا. احتضان لمدة 2 ساعة على الأقل في 37 درجة مئوية و 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون.

بعد الحضانة إضافة 6 ملليلتر من DMEM مع 10 في المئة FBS وخلايا حاضنة بين عشية وضحاها. ثم استبدال المتوسطة مع 12 ملليلتر من DMEM الطازجة مع 10 في المئة FBS واحتضان في 37 درجة مئوية و 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون حتى الحصاد. لاحظ الخلايا مرتين على الأقل يوميا.

قبل انفجار syncytia عندما اضطراب الغشاء تصبح الحصاد مرئية الفيروس. لحصاد الممر الأول إزالة عظمى من لوحة وإضافة 600 ميكرولترات من مصل المتوسطة الحرة. ثم استخدم رافع الخلية لكشط الخلايا ونقلها إلى أنبوب نظيف.

مباشرة بعد أن تجميد تعليق الفيروس في النيتروجين السائل وتخزينها في 80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل لضمان التجميد الشامل. لتحديد الثرات من مخزونات الفيروس في octuplicates لكل aliquot باستخدام 96 لوحات الجدار. أولا سحب الخلايا المنتجة من T75 خلية قارورة ثقافة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.

عد الخلايا وضبط تعليق الخلية إلى 150000 خلية لكل ملليلتر في DMEM مع 10 في المائة FBS. إضافة 90 ميكروليتر من DMEM مع 10 في المئة FBS في بئر من لوحة جدار 96. ثم إضافة 10 ميكروليتر من aliquot واحد من مخزون الفيروس إلى جميع الآبار 8 في العمود الأول من لوحة.

تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10 مرات على الأقل. استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 10 ميكرولترات من كل بئر، من الأول إلى العمود الثاني، وخلطها جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. كرر هذا لكل عمود للحصول على تخفيفات المسلسل عشرة أضعاف من الفيروس باستخدام نصائح ماصة جديدة لكل خطوة التخفيف.

تجاهل 10 ميكروليتر من كل بئر من العمود الأخير. إضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلية مع 150، 000 خلية لكل ملليلتر إلى كل بئر التأكد من عدم وجود كتل الخلية. احتضان في 37 درجة مئوية، 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.

تحقق من وجود syncytia باستخدام مجهر الضوء. عدد syncytia في كل بئر من العمود مع أعلى عامل تخفيف يحتوي على syncytia مرئية. بالنسبة للفيروسات التي تُعدّر مراسلًا فلوريًا، يمكن حساب syncytia باستخدام المجهر الفلوري.

لتحليل حركية تكرار فيروس الحصبة قبل يوم واحد من العدوى البذور 100، 000 خلايا فيرو في 1 ملليلتر من DMEM مع 10 في المئة FBS لكل بئر على 12 لوحات جدار مع ما لا يقل عن 2 آبار لكل نقطة وقت من الاهتمام. لتصيب الخلايا استبدال المتوسطة مع 300 ميكرولترات من مصل خال من المتوسطة التي تحتوي على كمية كل من الفيروس. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين على الأقل.

إزالة inoculum وإضافة 1 ملليلتر من DMEM مع 10 في المئة FBS ومواصلة الحضانة. في نقاط زمنية ذات صلة بعد عدوى حصاد progyny الفيروسية عن طريق كشط الخلايا مباشرة في الوسط. نقل المحتويات من كل بئر إلى أنبوب فردي.

ااكسر التجمد في النيتروجين السائل ويخزن عند 80 درجة مئوية حتى المعايرة ثم امضى كما هو موضح في المخطوطة. لبدء تقييم الخلايا المستحثة بوساطة BTE من خلال إطلاق LDH ، قم أولاً بعزل منتجات ترانسجين المفرزة التي تعبر عنها الخلايا المستهدفة المصابة بالفيروس وعزل الخلايا المناعية المؤثرة كما هو موضح في المخطوطة. ثم بذور الخلايا المستهدفة في لوحة جدار U-أسفل 96 وتشمل العينات كما هو موضح في المخطوطة.

إضافة الموامَع المناعي المعزول سابقاً عند التركيزات المطلوبة للعينات المعنية. إضافة الخلايا المنشقة المناعية في النسب المطلوبة وإضافة متوسطة إلى حجم إجمالي 100 ميكرولترات لكل بئر. احتضان للأطر الزمنية المطلوبة التي تم تحديدها سابقاً عند 37 درجة مئوية و 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون.

45 دقيقة قبل جمع عينة إضافة 10 ميكرولترات من 10X محلول تحلل إلى الآبار التي تحتوي على عينات T ماكس والضوابط المتوسطة المقابلة ومواصلة الحضانة. الطرد المركزي الخلايا في 250 مرة G لمدة 4 دقائق. نقل 50 ميكرولترات من اطالة من كل بئر إلى آبار من لوحة جدار 96 مسطحة أسفل التأكد من عدم نقل الخلايا.

بعد إعداد حل الركيزة وفقا للشركة المصنعة إضافة 50 ميكرولترات لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة أو حتى T عينات ماكس تتحول إلى اللون الأحمر العميق. بعد الحضانة إضافة 50 ميكرولتررس من وقف حل لكل بئر.

جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة في 4000 مرات G ومن ثم استخدام إبرة مجوفة لإزالة فقاعات الهواء. قياس الامتصاص البصري عند 490 نانومتر وحساب كما هو موضح في المخطوطة. بعد تلقيح مع غير معدلة وBTE ترميز على شكل تهتدّد الحصبة منحنيات نموّ النّواقل مقارنة على خلايا فيرو تظهر مماثلة.

منحنيات قابلية البقاء الخلية على mc38 مورين سرطاني القولون والمستقيم الخلايا التي تعبر بشكل ثابت المستضد سرطانيمبريوني الإنسان ومستقبلات MV CD46 بعد التطعيم تظهر أن النشاط اللين من فيروس ترميز transgene يتخلف في خط الخلية الورم مورين. أظهر قياس تدفق الخلايا المستضدة الهدف المعبر عن الخلايا المحتضنة مع BTE في خمسة تمييعات مختلفة BTE ملزمة من قبل الخلايا بطريقة تعتمد على التركيز. في مناعة بعد سحب المغناطيسي إلى أسفل من الخلايا المرتبطة BTE أظهرت أنه عندما تم استخدام عدم استهداف BTE لم تكن هناك كميات يمكن الكشف عنها من الخلايا;في حين أنه عند استهداف عينات BTE كانت تستخدم الخلايا المقيدة كانت موجودة في جزء elution.

ويشار إلى BTE المستضد المستهدف المحدد والتركيز السمية الخلوية تعتمد على خلايا مورين T من قبل ممثل LDH الافراج عن المقايسة ويبين أنه في المثال الحالي 15 في المئة قتل خلايا محددة تحققت في تركيز BTE عالية نسبيا من 1 ميكروغرام لكل ملليلتر مقارنة مع الخلايا المرجعية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تراقب الخلايا بانتظام للتحقق من تطور العدوى. لا تنس أن سلالات لقاح الحصبة المؤتلفة على الرغم من أنها مخففة قد تكون خطرة خاصة على الأفراد المثبطين للمناعة.

تجنب التعرض باتباع إجراءات السلامة الحيوية المناسبة. وينبغي تطعيم الأفراد الذين يتعاملون مع الفيروسات قبل تنفيذ هذه الأساليب. بعد هذا الإجراء يمكن تحقيق التعبير الفيروسي من transgenes أخرى من أجل تحليل التفاعلات المضيفين الفيروس والآثار العلاجية.

وقد مهد تطوير هذه التقنيات الطريق للباحثين في مجال العلاج الحيوي لاستكشاف آثار المواصفات المناعية المعبر عنها محليا في العديد من الكيانات السرطانية؛ في المختبر، في فيفو، وأيضا في التجارب السريرية.