استخدام المحتوى العالي من التصوير لقياس الهدف المشاركة في خلايا ملتصقة
نوفمبر 29, 2018
قياسات للمخدرات هدف المشاركة أمران أساسيان لتطوير العقاقير الفعالة والتحقق من صحة التحقيق الكيميائية. هنا، نحن تفاصيل بروتوكول لقياس الاشتباك المخدرات المستهدفة باستخدام التصوير عالية المحتوى في تكييف الميكروسكوبية المتوافقة المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا).
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البيولوجيا الكيميائية واكتشاف الأدوية. مثل, هل مركبك ربط البروتين الهدف? المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه لا يوجد شرط من انفصال الخلايا المتصونة.
ويمكن تحديد التوطين المكاني عن طريق التصوير. على الرغم من أننا قد طبقت هذه الطريقة في خطوط الخلية، فمن الممكن أيضا لتطبيق هذه الطريقة لأنظمة الخلايا الأخرى مثل الثقافات الأساسية والثقافات المشتركة. قبل بذر الخلايا، ضع لوحات فحص سوداء 384 بئرًا في غطاء لثقافة الأنسجة، واغطي اللوحات بورق الألومنيوم قبل استخدام حفر قياسي لإجراء ثلاثة ثقوب قطرها 3.5 ملليمتر على طرفي كل لوحة.
عندما تكون اللوحات جاهزة، استخدم تقنية معقمة لغسل ثقافة الخلايا A-431 مع 5 إلى 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. واحتضان الخلايا مع مليلترين من التربسين في 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا. بعد العد، وتمييع الخلايا إلى 5 مرات 10 إلى الخلايا 4 لكل ملليلتر في المتوسطة الثقافة، والبذور 40 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من كل لوحة المقايسة.
يهز بلطف كل لوحة من جانب إلى آخر بعد البذر لضمان توزيع متجانس للخلايا عبر قيعان البئر. لتقليل تأثيرات حافة اللوحة، السماح للخلايا بالاستقرار في الجزء السفلي من لوحات الفحص لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الجزء الخلفي من غطاء تدفق الفلام قبل وضع اللوحات في غرفة مرطبة مخصصة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. في يوم التجربة، استخدم غسالة لوحة لpirate المتوسطة من كل بئر.
وإضافة 30 ميكرولترات من مركب الفائدة في التركيز التجريبي المناسب إلى الآبار التجريبية المناسبة. ختم لوحات الفحص المعالجة بالمركب بأختام لوحة تنفس. وإرجاع اللوحات إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 دقيقة.
لفضح الخلايا لتحدي الحرارة، تعيين حمام الماء أولا إلى درجة الحرارة التجريبية المناسبة، ووضع لوحة وهمية غير المخاين التي تحتوي على نفس حجم المتوسطة في كل بئر لوحة المقايسة في الحمام، جنبا إلى جنب مع ميزان الحرارة الحرارية لرصد درجة الحرارة داخل الآبار. عندما تم الوصول إلى درجة الحرارة التجريبية المناسبة، وإزالة ختم تنفس من كل لوحة المقايسة وإعادة ختم لوحات مع رقائق الألومنيوم لاصقة ضيقة لضمان عدم تسرب المياه في الآبار خلال التدفئة اللاحقة في حمام الماء. الحفاظ على الثقوب المحفورة داخل إطار اللوحة يمكن الوصول إليها.
ضع لوحات الفحص ولوحة وهمية جديدة في حمام الماء ، مع قيعان الصفائح الزاوية نحو سطح الماء لإجبار أي هواء متبقي من تحت الألواح ، والبدء في مراقبة درجة حرارة اللوحة الوهمية الجديدة. التدفئة حتى من لوحة أمر بالغ الأهمية لأداء الفحص. الحرص على وضع لوحة في حمام الماء بحيث لا توجد فقاعات الهواء المحاصرين تحتها.
بعد ثلاث دقائق، على الفور تبريد لوحات في حمام ماء ثان من المياه درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق قبل تحليلها. لتصوير الخلايا، أولا إضافة 10 ميكرولترات من 16٪ شبهformaldehyde مباشرة إلى لوحات فحص لاحتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية فترة التثبيت، وغسل الخلايا مع 300 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني على غسالة لوحة، وإضافة 20 ميكرولترات من 0.1٪NP40 لاحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة ، وغسل الخلايا كما هو موضح. وحجب الخلايا مع 15 ميكروليتر من 1٪ من الألبومين المصل البقري، أو BSA، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم غسالة اللوحة لاستنشاق مصل الحجب ، وإضافة 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية ذات الاهتمام إلى الآبار المناسبة لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، وغسل كل بئر مع 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، وتسمية الخلايا مع 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. بالنسبة للتلوين النووي للخلايا، أضف 10 ميكرولترات من صبغة نووية مناسبة لكل بئر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني كما هو موضح.
تسمية الخلايا مع 10 ميكرولترات من قناع الخلية في بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تليها غسل الماضي مع برنامج تلفزيوني. ثم الاستغناء 60 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني جديد لكل بئر، وختم لوحات مع رقائق الألومنيوم حتى التصوير.
لتصوير الخلايا، التقط أربع صور في البئر على جهاز تصوير عالي المحتوى باستخدام القنوات الفلورية المناسبة تحت الهدف 10 مرات باستخدام التركيز التلقائي بالليزر وتطبيق binning على أثناء الاستحواذ. ثم تخزين الصور كملفات نقطة tiff رمادية 16 بت مع البيانات الوصفية. لا ينبغي أن تتعطل التعرف على الأجسام المضادة عن طريق التغيرات التشكلية في البروتين الهدف التي قد تكون مستحثة عن طريق ملزمة ليغاند.
على سبيل المثال، BIRB796 لديه معدل إيقاف طويل، وتحديد كمية المشاركة المستهدفة ممكن فقط عن طريق تطبيق خطوة استرداد مستضد. هذه التجربة التمثيلية منحنى التجميع الحراري للخلايا المعالجة بمركبات التحكم الإيجابية والسلبية توضح نطاقات تثبيت البروتين النموذجية بعد علاج الخلايا بالمركبات في درجات حرارة مختلفة. هنا نموذجي تجربة بصمة الجرعة الحرارية استجابة يظهر لإظهار نطاقات تمثيلية لتثبيت البروتين استجابة لجرعات مختلفة من مركب تجريبي.
تطبيق تحديات الحرارة الحرارية الأيزوحرارية للفحص المركب لتحديد المجلدات الجديدة للبروتين المستهدف يسمح بتحليل عدد كبير من المركبات بتركيز واحد في وقت واحد، قبل بصمة الجرعة الحرارية للإستجابة للإيدز لتأكيد استقرار البروتين المستهدف. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن الظروف التجريبية الدقيقة، مثل طول ودرجة حرارة التحدي الحراري تؤثر على القوة الملحوظة للمركبات. لا تنس أن العمل مع شبه شكلي يمكن أن تكون خطرة للغاية.
وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات، مثل اتباع المبادئ التوجيهية للسلامة المؤسسية، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
توضح هذه المقالة بروتوكولاً لقياس ارتباط الدواء بالهدف باستخدام تصوير المحتوى العالي في تكيف متوافق مع الألواح المجهرية لاختبار التحول الحراري الخلوي (CETSA). يعتبر هذا الأسلوب ضروريًا للإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء الكيميائي واكتشاف الدواء.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- البيولوجيا الكيميائية
- اكتشاف الدواء
- تقنيات التصوير
الخلفية
- ارتباط الدواء بالهدف ضروري لتطوير الدواء الفعّال.
- اختبار التحول الحراري الخلوي (CETSA) هو أداة قيّمة في هذا السياق.
- يسمح هذا الأسلوب بالتحديد المكاني من خلال التصوير.
- يمكن تطبيقه على أنظمة خلوية مختلفة، بما في ذلك الثقافات الأولية والثقافات المشتركة.
هدف الدراسة
- تحديد ما إذا كان المركب يرتبط بالبروتين المستهدف.
- للتحقق من الأدوات الكيميائية في تطوير الدواء.
- لتعزيز فهم تفاعلات الدواء والهدف.
الأساليب المستخدمة
- تصوير المحتوى العالي بتنسيق الألواح المجهرية.
- تحضير ألواح الفحص التصويرية ذات 384 بئرًا أسود.
- استخدام رقائق الألمنيوم لتغطية الألواح أثناء زرع الخلايا.
- حفر فتحات في الألواح للتعامل السليم.
النتائج الرئيسية
- يسمح الأسلوب بقياس فعال لارتباط الدواء بالهدف.
- يوفر تحديدًا مكانيًا لتفاعلات الدواء.
- قابل للتطبيق على أنواع خلوية مختلفة تتجاوز الخطوط الخلوية.
- يسهل التحقق من الأدوات الكيميائية.
الاستنتاجات
- هذا البروتوكول هو تقدم مهم في تقنيات اكتشاف الدواء.
- يوفر طريقة موثوقة لتقييم تفاعلات الدواء والهدف.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى أنظمة بيولوجية أكثر تعقيدًا.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Quantifying drug-target engagement in adherent cells is a pivotal inflection point for target validation and early drug discovery. High content imaging adaptation of CETSA enables direct, modification-free assessment of compound binding, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking in heterogeneous cell populations. This workflow advances portfolio triage by providing robust, spatially resolved engagement data at scale.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of compound-target binding in physiologically relevant adherent cells.
- Supports functional target validation without requiring protein or ligand modification.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing compound effects in heterogeneous cell populations.
- Provides quantitative engagement data to inform go/no-go decisions in discovery portfolios.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, plate-based readiness for screening compound libraries.
- Ensures assay reproducibility and standardization through automated imaging and analysis.
- Generates quantitative, spatially resolved readouts for robust compound evaluation.
- Enables scalable platform reuse across diverse cell systems, including primary and cocultures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns compound engagement data with disease-relevant cellular contexts when using primary or coculture systems.
- Supports translational continuity by bridging discovery findings to preclinical model validation.
- Reduces biological risk by confirming target engagement in complex, heterogeneous populations.
Pipeline & Workflow Integration
This high content CETSA workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and downstream screening.
- Discovery Biology: Provides direct evidence of target engagement, clarifying pathway relevance and reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Offers high-throughput, quantitative, and reproducible outputs for compound triage.
- Analytics: Enables statistical comparison of engagement across compounds, doses, and conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant systems by accommodating primary and coculture models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, modification-free platform for repeated use across programs and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces late-stage attrition by confirming target engagement in relevant cell systems.
- Operational Value: Standardizes workflows and enables reproducible, high-throughput data generation.
- Strategic Value: Informs portfolio decisions with robust, quantitative engagement metrics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high content imaging and quantitative image analysis.
- Demands access to automated imaging platforms and compatible assay plates.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions and data analysis pipelines.
- Adaptable to various adherent cell systems, including primary and cocultures, with protocol optimization.
- Experimental parameters such as heat challenge duration and temperature must be empirically determined for each target.
