تصور لهيكل ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام تلطيخ كل جبل

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الدهنية، مثل كيفية تغير التفاعلات بين الخلايا وعلم وظائف الأعضاء في الأنسجة الدهنية عند ظروف التمثيل الغذائي المختلفة مثل الصيام والسمنة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يحافظ على الهيكل الدهني 3D الأصلي ويتجنب خطوات المعالجة الطويلة التي عادة ما تكون مطلوبة للكيمياء المناعية التقليدية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في بنية الأنسجة الدهنية، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أجهزة الجهاز الأخرى، مثل الجهاز العصبي، عن طريق تركيب كامل تلطيخ الدماغ.

عموما، سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال بسبب الصعوبات في الحصول على مواقع الأنسجة الملكية، وإيجاد فترة التثبيت المناسبة، وتركيزات الأجسام المضادة الأمثل. بعد اكتمال التشريح، نقل الطبق الذي يحتوي على عينات الأنسجة في 1٪ شبهformaldehyde من الجليد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم نقل الأنسجة إما إلى 12 أو 24 جيدا خلية لوحة ثقافة لغسل أسرع.

من المهم أن نتذكر أن إجراء تلوين كامل جبل يجب أن تبدأ مباشرة بعد تشريح وأنه لا توجد نقاط وقفة بين كل خطوة. اغسل الأنسجة باستخدام PBS-0.3T على شاكر مائل عند 22 درجة بسرعة تتراوح بين 20 و25 ميلًا في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كرر هذا غسل مرتين إضافيتين.

بعد هذا، إضافة ما يقرب من 0.5 إلى ملليلتر واحد من العازلة حظر تحتوي على مصل الحيوانات 5٪. احتضان لوحة على شاكر باستخدام الشروط السابقة لمدة ساعة واحدة. التعرق حل الحجب، وإضافة على ملليلتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في PBS-0.3T مع مصل الحيوانات 1٪ إلى كل بئر.

احتضان لوحة بين عشية وضحاها على شاكر في أربع درجات مئوية مع ميل من 22 درجة وسرعة من 20 إلى 25 يميل في الدقيقة الواحدة. في اليوم التالي، استخدم PBS-0.3T لغسل الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كرر هذا غسل مرتين إضافيتين.

ثم، إضافة بين 0.5 وميليلتر واحد من المناسب ومخففة حلول الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر. التفاف لوحة في رقائق الألومنيوم واحتضان ذلك على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، اغسل الطبق مرتين مع PBS-0.3T في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل غسل.

إذا كان هناك حاجة إلى تصور قطرات السائل أثناء وصمة عار الدهون محايدة، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X مع كل غسل يدوم خمس دقائق. إضافة وصمة عار الدهون محايدة مخففة في برنامج تلفزيوني، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لبدء التصوير، استخدم ملقط لوضع الأنسجة المسطحة على زلة غطاء زجاجي 24 في 60 ملليمتر.

إذا كان من المطلوب تلطيخ النوى مع DAPI، إضافة واحدة إلى 2 قطرات من المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي على DAPI لغمر الأنسجة تماما ومنعها من التجفيف. ثم، ضع الشريحة على نظام مجهر ليزر مقلوب. للحصول على صور للأنسجة الملوّقة كاملة التركيب في عدة طائرات محورية، قم بأداء رصّات Z من 100 إلى 150 ميكرومتر في العمق مع حجم الخطوة من أربعة إلى ستة ميكرومترات في التكبير المطلوب.

في هذه الدراسة، يتم استخدام تلطيخ كامل للحفاظ على بنية الأنسجة الدهنية. على عكس الطرق التي تنطوي على خطوات معالجة متعددة والقسم ، والتي يمكن أن تؤدي إلى تشويه مورفولوجيا الأنسجة الدهنية ، يمكن أن تحافظ طريقة تلطيخ التركيب بالكامل على مورفولوجيا الخلايا الشحمية ، مما يضمن الدقة عند تفسير النتائج. الإفراط في الأنسجة الدهنية يؤدي إلى الفلورسيات المثبتة التي تسبب، والتي يمكن الإشارة إليها من قبل المناطق متطابقة متداخلة، كما هو الحال في إشارات التيروزين هيدروكسيلاس و PECAM-1 ينظر هنا.

غير أن عينات البقع المثبتة بشكل صحيح، والمركبة الكاملة، تظهر إشارات منفصلة ومتميزة، مما يشير إلى أن هذه الإشارات ليست تلقائية الفلوروس. التصوير كامل جبل الأنسجة الدهنية الملون يسمح لك quantism للتغيرات المورفولوجية تحت ظروف تجريبية مختلفة. على وجه الخصوص، هو الأنسجة الدهنية الأوعية الدموية للغاية، وهو أمر مهم في التوسط التوازن الأيضي على التغيرات السريعة في مستوى الطاقة.

على سبيل المثال ، C57 الأسود 6J الفئران ، التي تمر 24 ساعة من الصيام ، وعرض أصغر بكثير من حجم adipocyte ، مما يدل على تحلل الدهون ، واتجاه في ارتفاع كثافة الأوعية الدموية بالمقارنة مع الفئران التي تتغذى باستمرار. إزالة الأنسجة الدهنية مع iDISCO + تمكن الأنسجة الدهنية لتصبح شفافة بصريا. يُظهر التميّز المناعي للأنسجة الدهنية التي مرت عبر إزالة الأنسجة الاربورية العصبية الأكثر كثافة مقارنة بتلك التي لوحظت في تلوين الماونت بالكامل دون إزالة الأنسجة في نفس التكبير.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر عدم الإفراط في وضع العينات الخاصة بك لأكثر من ساعة في درجة حرارة الغرفة في PFA ، وإلا ، فإن هذا سيزيد من الفلوروس الخلفية. ومع ذلك، يمكن أن تكون هذه الفترة التثبيت طويلة إذا تم تثبيت العينات في أربع درجات مئوية. بعد هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل القياس الكمي باستخدام ImageJ ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل كيفية تغيير البنية الخلوية ، مثل مواقع الخلايا الدهنية وكثافة الأوعية الدموية ، استجابة للظروف الفسيولوجية المختلفة.