الجيش الملكي النيبالي على إعادة برمجة الليفية الأولية البشرية داخل الخلايا الجذعية المستحثة Pluripotent

نظرا لكفاءتها العالية، يمكن لهذه الطريقة مزيد من التقدم الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات، أو IPSCs كأداة لدراسة الأمراض البشرية وتطوير علاجات الخلايا الجذعية الجديدة. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي القدرة على توليد التكامل عالية الجودة IPSCs خالية من الخلايا الليفية الأساسية البشرية بما في ذلك صعوبة إعادة البرمجة، والمرض المرتبطة بها، والشيخوخة، والأرومية الليفية senescent. نجاح هذا الأسلوب يعتمد على كفاءة RNA القصوى من الخلايا الليفية.

وضبط pH من المخزن المؤقت transfection هو إجراء رئيسي لتحقيق ذلك. للبدء، وإعداد العازلة transfection باستخدام 500 ملليلتر و 100 ملليلتر درجة حرارة الغرفة زجاجات قبل الدافئة من متوسط مصل جديد مخفض. قياس درجة الوهن الأساسي للوسيلة في زجاجة 500 ملليلتر عن طريق إدخال القطب الزجاجي لمعرض درجة اله pH في المخزن المؤقت، وانتظر حتى دقيقة واحدة قبل قراءة الرقم الـ PH.

لضبط درجة الـ PH، أضف من ثلاثة إلى أربعة ملليلترات من هيدروكسيد الصوديوم الضرس في زجاجة 500 ملليلتر. أغلق الزجاجة واخلطيها جيداً. بعد الانتظار لمدة خمس دقائق، افتح الزجاجة وأدخل قطب مقياس الرقم الـ H في المخزن المؤقت.

انتظر حتى تستقر القراءة على مقياس pH. استمر في إضافة كميات صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم الضرس حتى يصل إلى 8.15 إلى 8.17، مع التأكد من معايرة مقياس الـ pH عدة مرات أثناء العملية. استخدام 0.22 ميكرومتر فراغ الترشيح نظام لتصفية تعقيم العازلة transfection.

Aliquot المخزن المؤقت المعقم إلى خمسة أنابيب ملليلتر مع الحد الأدنى من المساحة الجوية. تحقق من أن الخلايا الليفية التي سيتم إعادة برمجتها هي بنسبة 40٪ إلى 60٪ التقاء. نقل أربعة ملليلتر من DPBS إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، وإضافة 100 ميكرولترات من اللامينين البشري المؤتلف 521.

تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. إضافة ملليلتر واحد في بئر من اللامينين الإنسان المخفف المؤتلف 521 في ثلاثة آبار من لوحة ستة بئر. احتضان هذه اللوحة المغلفة في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

خلال هذا الحضانة، دافئة ستة ملليلتر من التوسع الليفي المتوسطة وأربعة ملليلتر من الطلاء المتوسطة إلى 37 درجة مئوية. تكملة المتوسطة الطلاء مع FGF الأساسية بتركيز نهائي من 100 نانوغرام لكل ملليلتر و B18R بتركيز نهائي من 200 نانوغرام لكل ملليلتر. التعرق بعناية المتوسط المستهلكة من الخلايا الليفية التي هي في 40٪ إلى 60٪ التقاء.

شطف الخلايا مع خمسة ملليلتر من DPBS. إضافة ثلاثة ملليلتر من التربسين EDTA وروك بلطف لوحة لتغطية الخلايا مع تريبسين EDTA. pirate السوائل الزائدة، وترك ما يقرب من 500 ميكرولترات من التربسين، واحتضان الخلايا الليفية لمدة ثلاث دقائق في 37 درجة مئوية.

بعد إزالة لوحة من الحاضنة، بحزم ولكن بعناية الاستفادة من جانب لوحة لإزاحة الخلايا. عرض الخلايا تحت المجهر للتحقق ما إذا كان قد تم فصلها. إضافة خمسة ملليلترات من الليفي توسيع المتوسطة إلى الخلايا المنفصلة لتحييد EDTA التربسين.

جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر ومزجها جيدا. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت، ثم الماصات 12، 000 الخلايا في أربعة ملليلتر من قبل معدة مسبقا واسطة الطلاء الدافئة. بعد إزالة اللوحة المغلفة من الحاضنة، pirate المصفى laminin 521 من الآبار، والتأكد من أن سطح الآبار لا يجف.

بلطف resuspend الخلايا التي هي في وسط الطلاء وإضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية في كل المغلفة جيدا. ضع الخلايا المطلية في حاضنة ثقافة الأنسجة ثلاثية الغاز مع انخفاض الأكسجين أو الأكسجين تعيين إلى 5٪ ثم بلطف ولكن تفريق الخلايا بدقة بالتناوب بين أعلى أسفل، ثم اليسار حركة اليمين، وتكرار الاقتراحات مرتين أكثر، والتأكد من عدم دوامة لوحة. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها.

وفي الوقت نفسه، إضافة أربعة ملليلترات من إعادة برمجة المتوسطة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، ووضعها في حاضنة O اثنين منخفضة مع سقف خففت لتكليل بين عشية وضحاها. على الأقل ساعة واحدة قبل transfection، إزالة وسيط إعادة البرمجة التوازنية من حاضنة O اثنين منخفضة. أضف bFGF إلى تركيز نهائي يبلغ 100 نانوغرام لكل ملليلتر، و B18R إلى تركيز نهائي يبلغ 200 نانوغرام لكل ملليلتر، واخلط جيداً.

العمل بشكل جيد واحد في وقت واحد، واستخدام ماصة ملليلتر واحد لإزالة المتوسطة المستهلكة. واستبدالها بميليلتر واحد من إعادة برمجة المتوسطة، تستكمل مع bFGF وB18R. نقل لوحة مع الخلايا مرة أخرى إلى حاضنة الأوكسجين منخفضة.

لبدء transfection الخلايا الليفية، اكويليبريلت أولاً aliquot من العازلة transfection لمدة ساعة واحدة تقريبا في درجة حرارة الغرفة. إزالة واحد 33 ميكرولتر aliquot من MRNAs المعدلة و 14 ميكرولتر aliquot من ميرنا يحاكي من السلبية 80 درجة مئوية، والدفء لهم إلى درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق تقريبا حتى يذوب. تدور عليهم لفترة وجيزة في microfuge.

ادفأ كاشف نقل الملوثات إلى درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق تقريبًا. عكس أنبوب مرتين إلى ثلاث مرات لخلط الكاشف وتدور عليه لفترة وجيزة في microfuge. نقل 279 ميكرولترات من المخزن العازلة نقل درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب RNAs الحرة microcentuge، وإضافة 31 ميكرولترات من كاشف transfection.

تخلط جيدا عن طريق الأنابيب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. إضافة 132 ميكرولترات من العازلة transfection درجة حرارة الغرفة إلى 33 ميكرولتر aliquot من MRNA المعدلة، وماصات بلطف لخلط. إضافة 102.6 ميكرولترات من العازلة transfection درجة حرارة الغرفة إلى 14 ميكرولتر aliquot من MIRNA يحاكي وماصات بلطف لخلط.

لإعداد مزيج transfection من MRNA المعدلة، إضافة 165 ميكرولترات من 310 microliters العازلة transfection، ومزيج refection reagent إلى 165 ميكرولترات من العازلة transfection، وتعديلها MRNA مزيج. ماصة لخلط. لإعداد مزيج transfection من MIRNA يحاكي، إضافة 116.6 ميكرولترات من 310 المخزن المؤقت transfection ميكرولتر، مزيج مُكَدَر transfection إلى 116.6 المخزن المؤقت transfection ميكرولتر، MIRNA تقليد المزيج.

اخلط جيداً وحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للمخزن المؤقت بالتعمير إلى مركب مع MRNAs المعدلة ومحاكاة MIRNA. إزالة لوحة مع الخلايا من حاضنة انخفاض الأكسجين. إسقاط الحكمة عبر كل بئر، إضافة 100 ميكرولترات في بئر من مزيج transfection التي تحتوي على معقدة، وتعديل MRNAs.

بلطف ولكن تماما يهيج لوحة مع ما يصل إلى أسفل، ثم اليسار حركة اليمين لتفريق المجمعات transfection. إضافة 66.7 ميكرولتررس في بئر من مزيج transfection التي تحتوي على ميرنا معقدة يحاكي قطرة الحكمة عبر كل بئر. بلطف ولكن تماما يهيج لوحة مع ما يصل إلى أسفل، ثم اليسار حركة اليمين لتفريق المجمعات transfection.

ضع الطبق مع الخلايا المصابة في حاضنة الغاز الثلاثي مع انخفاض الأكسجين. تفريق المجمعات transfection بواسطة بلطف ولكن تماما يهيج لوحة مع أعلى إلى أسفل، ثم اليسار الحركة اليمنى. احتضان الخلايا المصابة في الحاضنة لمدة 16 إلى 20 ساعة قبل تغيير الوسط في اليوم التالي.

إضافة أربعة ملليلترات من إعادة برمجة المتوسطة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، ووضعها في حاضنة O اثنين منخفضة مع سقف خففت لتكدير بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، استبدل النقل الذي يحتوي على وسيط مع المتوسطة الجديدة قبل التوازن تستكمل مع bFGF و B18R والاستمرار في نظام transfection كما هو موضح في البروتوكول. بعد الطلاء الناجح في بئر من طبق تنسيق ستة جيدا لإعادة البرمجة، ظهرت الخلايا الليفية متناثرة جدا.

بعد 24 ساعة من أول عملية نقل ناجحة ، فقدت الخلايا الليفية شكلها المغزل واعتمدت مورفولوجيا أكثر تقريبًا. وطوال عمليات النقل الثلاث الأولى، زادت كثافة الخلايا تدريجياً وباستمرار مع انفجار واضح في الانتشار الذي يحدث بين سبعة أيام وثمانية أيام. وبحلول اليوم العاشر، بدت الخلايا اُلّت إلى حد كبير.

ظهرت مستعمرات IPSC الأولى في وقت مبكر من اليوم 11. بحلول أيام 15 إلى 17، أصبحت مستعمرات IPSC كبيرة وواضحة ومتميزة بوضوح عن الخلايا الليفية المحيطة وغير المبرمجة بالكامل. وأكد الكبت المناعي لعلامة متعددة القدرات TRA-1-60 كفاءة عالية في إعادة البرمجة.

كثافة الطلاء دون المستوى الأمثل هو السبب الأكثر شيوعاً للتقليل من كفاءة إعادة البرمجة في هذا البروتوكول. إذا كانت كثافة الطلاء منخفضة للغاية ، ظهرت بقع بارون الخلايا الكبيرة ولم تتشكل مستعمرات IPSC. بعد مرور التخفيف من الخلايا التي أعيد برمجتها، نمت IPSCs كمستعمرات واحدة وكانت قابلة للتمييز بسهولة عن الخلايا الليفية.

كانت معبأة بشكل فضفاض وكان الخلايا الفردية منطقة كبيرة نسبيا السيتوبلازم. على مدى أربعة إلى سبعة أيام، انتشرت IPSCs وشكلت مستعمرة مميزة معبأة بإحكام مع حواف محددة. وأظهرت الخلايا الفردية داخل المستعمرة جزءا كبيرا من النووية مع نوى بارزة.

بعد إعادة برمجة الخلايا الليفية المريض, يمكن أن تختلف IPSCs الناتجة في مجموعة متنوعة من الخلايا الجسدية من أجل توضيح آليات مسببة للمرض أو تطوير علاجات جديدة الخلايا التجدد.