تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي الماوس باستخدام الفرز اليدوي وضعف في المختبر النسخ تهم المطلق بالتسلسل (DIVA-Seq)

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في حل عقبة رئيسية في مجال عزل الخلايا العصبية الواحدة والتسلسل. مثل جمع سكان محدد أو مجموعة فرعية من الخلايا العصبية المسماة الفلورسنت من منطقة الدماغ المعرفة من قبل المستخدم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تضمن القبض على الخلايا العصبية ذات الاهتمام الواحد دون تلويث الحطام.

كما أنها لطيفة نسبيا, وهو أمر مهم لأنواع الخلايا العصبية الهشة التي تموت بسرعة عندما تتعرض لضغوط السوائل من الفرز FACS التقليدية. تبدأ من خلال إعداد الزجاج المسحوب microcapillaries مع 10 إلى 15 ميكرون قطر الخروج باستخدام سحب شعري. استخدام مقص غرامة لقطع غيض من الشعرية للحصول على قطر المجلس المطلوب.

ثم استخدام وصلات أنابيب لإرفاق 120-150 سم طول أنابيب السيليكون مرنة مع 0.8 ملليمتر داخل القطر إلى 0.2 ميكرون PVDF غشاء محاقن مرشح وصمام أنابيب في اتجاهين. إعداد 500 ملليلتر من السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي المبرد أو ACSF والأكسجين عن طريق محتدما 5٪ ثاني أكسيد الكربون الأكسجين متوازنة من خلال Airstone لمدة 15 دقيقة أو حتى الحل يمسح تماما. إعداد ثلاثة 150 ملليلتر قارعة تحتوي كل منها على 100 ملليلتر من ACSF.

إلى واحد، إضافة مزيج من حاصرات النشاط. إلى آخر، إضافة كسر المكورات العقدية للبروتيز إلى تركيز نهائي من مليغرام واحد لكل ملليلتر. إلى الكأس النهائي، إضافة FBS إلى تركيز النهائي من 1٪، والأكسجين مع 5٪ الأكسجين متوازنة ثاني أكسيد الكربون من خلال Airstone.

وأخيرا، جعل ثلاثة ماصات باستور طويلة ينبع مع انخفاض أقطار الخروج عن طريق المتداول لهم على لهب مفتوح. تشريح الدماغ من فأر القتل الرحيم عن طريق فتح الجمجمة مع مقص صغير واستخراج الدماغ الطازج باستخدام ملقط غرامة دون الإضرار القشرة. ضع الدماغ في ACSF المبرد والأكسجين وترك Airstone متصل بالأكسجين المتوازن من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪خلال مدة القسم بأكملها.

ضع الدماغ على تشاك هزلي وقطع أقسام الإكلالي أو القوس في 300 ميكرون سمك. جمع العديد من المقاطع حسب الحاجة للحصول على الحد الأدنى من 10 إلى 50 الخلايا المسماة. وضع شرائح على حامل شريحة القطن المتشابكة وضعت داخل منقار حتى يتم استحمها في ACSF المؤكسج.

حرك الشرائح إلى القارس التي تحتوي على ACSF مع حاصرات النشاط وكتلة لمدة 15 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في حين محتدما الأكسجين باستخدام Airstone. حرك الشرائح إلى القارس التي تحتوي على ACSF مع محلول البروتياز لإجراء عملية الهضم المعتدل في درجة حرارة الغرفة. بعد الهضم، اغسل البروتياز عن طريق تحريك الشرائح إلى الجزء الذي يحتوي على ACSF مع محلول مانع النشاط لمدة تتراوح بين خمس إلى عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.

الحفاظ على الأكسجين محتدما. المقبل، وإعداد 100 ملليمتر بتري طبق يحتوي على ACSF مع 1٪ FBS في درجة حرارة الغرفة ونقل المقاطع الفردية في القرص للmicrodissection. تحت نطاق تشريح الفلورسنت، استخدم زوج من ملقط غرامة لتشريح المناطق الدقيقة وطبقات من الفائدة وجود ما لا يقل عن 10 إلى 50 الخلايا.

باستخدام ماصة باستور، نقل القطع تشريح الصغرى إلى أنبوب microcentuge 2 ملليلتر التي تحتوي على ما يقرب من 0.8 ملليلتر من 1٪ FBS في حل ACSF. تثليط الأنسجة تشريح في أنبوب ميكرو فوج في درجة حرارة الغرفة. أداء ما يقرب من 10 السكتات الدماغية مع كل من الماصات باستور ملتهب بدءا من أكبر وتنتهي مع أصغر قطر الخروج.

الاستغناء عن الخلايا المنفصلة في طبق بيتري 100 ملليمتر يحتوي على ACSF المؤكسج وانتظر خمس إلى سبع دقائق الخلايا لتسوية تدريجيا. مراقبة إشارة GFP وRFP تحت مجهر تشريح. تحديد الحطام من خلال فحص مورفولوجيا تحت الإضاءة في المجال الساطع.

مرة واحدة تم تحديد مساحة من الخلايا مع القليل من الحطام، واستخدام الشعرية والتعلق الأنابيب لالتقاط الخلايا عن طريق سد نهاية صمام الأنابيب مع اللسان. ثم ضع الشعيرات الدموية بالقرب من الخلايا. الافراج عن كتلة على شعرية وبسرعة كتلة مرة أخرى لالتقاط الخلية باستخدام عمل شعري.

نقل الشعيرية إلى طبق بيتري 100 ملليمتر مع ACSF أكسجين الطازجة وضربة بلطف في الأنبوب أثناء مراقبة طرف الشعرية تحت بصريات الفلوريسل للاستغناء عن الخلايا في الطبق. كرر إجراء الجمع حتى يتم جمع 100 إلى 150 خلية مع التأكد من أن الملوثات، مثل الحطام، هي الحد الأدنى في مجال مشرق التداخل التفاضلي النقيض البصريات. وأخيرا، باستخدام ماصة شعرية صغيرة جديدة في كل مرة، واختيار خلية واحدة وطرده في ما لا يزيد عن 0.5 ميكرولترات في أنبوب 0.2 ميكرولتر مايكرو فوغ يحتوي على ميكرولتر واحد من عينة جمع العازلة مع التمهيديات.

كسر تلميح ماصة في أنبوب مايكرو fuge لضمان أن الخلية يبقى في المخزن المؤقت جمع. تجميد الخلايا عن طريق وضع الأنابيب على الجليد الجاف. يُخزن في ثلاجّة مئوية ناقص 80 درجة حتى معالجة تضخيم الحمض النووي الريبي.

تم عزل الخلايا العصبية GABAergic من قشرة cingulet من دماغ الماوس. تضخيم الجيش الملكي النيبالي من الخلايا العصبية فرزها يدويا تراوحت بين 200 إلى 4، 000 أزواج قاعدة في الحجم مع توزيع الذروة قليلا فوق 500 أزواج قاعدة. بعد تنقية الخرزة ، يتم تقييد مكتبة cDNA بمزيد من الحجم من خلال جولة ثانية من التنقية باستخدام الخرز للقضاء على الأجزاء الأقل من 200 زوج أساسي وللذروة في حوالي 350 زوجًا أساسيًا.

وأظهر التسلسل 4.8 مرات 10 إلى الوسيط الخامس أو 6.9 مرة 10 إلى القراءة التي تم تعيينها في 5th لكل خلية. بعد إزالة RNA مكررة باستخدام UMIs، كل خلية واحدة كان 1.0 مرات 10 إلى الوسيط 5 أو 1.4 مرات 10 إلى المتوسط 5 قراءات فريدة لكل خلية. في كل خلية واحدة رنا الخارجية ضوابط الاتحاد، تم استخدام ارتفاع في الجيش الملكي النيبالي كتحكم داخلي لحساب العدد المطلق من الجزيئات المضافة إلى العينة.

كانت هناك علاقة خطية من المدخلات إلى عدد ملاحظ مع ميل 0.92 وR معدلة مربع 0.94. تم الكشف عن متوسط حوالي 10,000 جينات لكل خلية عصبية واحدة باستخدام هذا الإجراء مع أكثر من 95٪ من الخلايا الفردية التي تكتشف أكثر من 6,000 جينات. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق لعلماء الأحياء الجزيئية لاستكشاف نسخة من الماوس المتميزة ذات تميز جيد interneurons القشرية ، وحددت فئات الجينات المختارة المسؤولة عن ترميز الهوية الخلوية.