تنقية خطوة واحدة من المجمعات الجزيئات باستخدام الحمض النووي الريبي يعلق على البيوتين ورابط صور كليفابل
يناير 3, 2019
الجيش الملكي النيبالي/البروتين المجمعات تنقيته باستخدام استراتيجية ستريبتافيدين botin هي التيد للحل في ظل الظروف يشوه بشكل غير مناسب لمزيد من التنقية والتحليل الوظيفي. وهنا يصف لنا تعديل هذه الاستراتيجية التي تستخدم رابط صورة كليفابل في الجيش الملكي النيبالي، وخطوة شطف الأشعة فوق البنفسجية لطيف، تسفر عن مجمعات الجيش الملكي النيبالي/البروتين الأصلي وتعمل بكامل طاقتها.
وينبغي أن تكون هذه الطريقة ذات فائدة للباحثين الذين يحاولون عزل مجمعات البروتين الحمض النووي الريبي وتحديد تكوينها عن طريق القياس الطيفي الشامل. ونحن نعتقد أن بروتوكول لدينا سوف تكون مفيدة بشكل خاص لتنقية المجمعات الموجودة في الخلايا بكميات محدودة وتميل إلى فصل خلال إجراءات تنقية متعددة الخطوات طويلة. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تنطوي على خطوة تنقية واحدة فقط ويمكن استخدامها مع مواقع الربط RNA من أي طول وتسلسل.
ومن بين الخطوات التي سيتم فيها وضع شياو-كوي يانغ، وهو أحد كبار فنيي البحوث في مجموعتنا. وبالنسبة لمواقع الربط التي تزيد كثيراً عن 65 نيوكليوتيدات، احصل على مادة T7 المولدة من الحمض النووي الريبي (RNA) والمحول ثنائي الفينيل متعدد الكلور oligonucleotide كما هو مبين في بروتوكول النص. مزيج 20 picomoles من الجيش الملكي النيبالي مع 100 picomoles من oligonucleotide محول في أنبوب 1.5 ملليلتر تحتوي على 100 ميكرولترات من العازلة ملزمة.
ضع الأنبوب في الماء المغلي واتركه يحتضن لمدة 5 دقائق. ثم تسمح للماء لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. الملحق الأول 1 ملليلتر من استخراج الماوس النووية مع EDTA 80 ملليمولار في 8 درجة PH إلى تركيز نهائي من 10 ملليمولار.
ثم إضافة بين 5 و 10 picomoles من الركيزة RNA التي تم وضع علامة مع moiety PCB. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق، مع التأكد من خلط العينة في بعض الأحيان. بعد ذلك استخدام ميكروسنتروجي قبل التبريد في 4 درجات مئوية إلى الطرد المركزي الخليط في 10، 000 مرات ز لمدة 10 دقائق لإزالة أي الترسبات المحتملة.
جمع بعناية في supernatant في أنبوب جديد على الجليد، مع الحرص على تجنب نقل بيليه. نقل ما يقرب من 100 ميكرولترات من streptavidin تعليق الخرز agarose إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة ما يقرب من 1 ملليلتر من العازلة ملزمة لبدء غسل الخرز.
الطرد المركزي الأنبوب في 25 مرات ز لمدة 2 إلى 3 دقائق وpirate اسخناب. كرر هذه عملية الغسيل والطرد المركزي 2 إلى 3 مرات لتكبيل الخرز مع العازلة ملزمة. تحميل supernatant التي تم جمعها سابقا ، والذي يحتوي على مجمع تجميعها على الخرز التوازنية.
باستخدام دوار أنبوب، تدوير الأنبوب لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية لشل الجيش الملكي النيبالي والمجمعات ملزمة على الخرز. تدور المقبل الأنبوب في 25 مرات ز لمدة 2 إلى 3 دقائق لجمع الخرز في الجزء السفلي من الأنبوب. استلهموا المُنطّع.
وشطف الخرز مرتين مع العازلة ملزمة، وذلك باستخدام عملية الغسيل الموصوفة سابقا. بعد إزالة افرنح من غسل الثاني، إضافة 1 ملليلتر من العازلة ملزمة وتدوير العينة لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية. تدور أسفل العينة في 25 مرات ز لمدة 2 إلى 3 دقائق.
أضف التالي 1 ملليلتر من العازلة ملزمة ونقل التعليق إلى أنبوب جديد. قم بتدوير العينة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ساعة واحدة. أجهزة الطرد المركزي المجمعات غير المُشلَّة في 25 مرة ز لمدة 2 إلى 3 دقائق.
ثم pirnatate supernatant ، وإضافة 200 ميكرولترات من العازلة ملزمة. نقل الخرز إلى أنبوب 500 ميكرولتر. قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية عالي الكثافة الذي ينبعث منه ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 365 نانومتر ويسمح له بالوصول إلى التألق الكامل.
ملء الجزء السفلي من طبق بيتري مع الجليد معبأة بإحكام التراص على غطاء الطبق. دوامة وجيزة الأنبوب الذي يحتوي على المجمعات غير المُشلَّلة. ثم ضعه أفقياً على الجليد واغطيه بالمصباح الذي تم تسخينه قبل ذلك، مع التأكد من أن العينة تتراوح من 2 إلى 3 سنتيمترات من سطح المصباح.
تشع العينة لمدة إجمالية 30 دقيقة بينما كثيراً ما تُعكس وتدامة الأنبوب لضمان التعرض الموحد ومنع ارتفاع درجة الحرارة. بعد ذلك، تدور أسفل الخرز في 25 مرات ز لمدة 2 إلى 3 دقائق وجمع ناظر. جهاز طرد مركزي هذا الماسخ مرة أخرى باستخدام نفس الشروط.
جمع نابيراتون الناتجة التأكد من ترك كمية صغيرة في الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب نقل أي الخرز المتبقية. باستخدام الكهرباء SDS-PAGE، فصل جزء من UV مائل فائقة والكسر المقابل من المواد المتبقية على الخرز بعد elution الأشعة فوق البنفسجية. المقبل استخدام طقم ملونة الفضة المتاحة تجاريا لطخة هلام.
تقييم كفاءة elution الأشعة فوق البنفسجية من خلال مقارنة شدة البروتينات الموجودة في UV eluted فائقة وتلك التي تركت على الخرز بعد الأشعة فوق البنفسجية. اكوس نطاقات البروتين من الفائدة وتحديد هوياتهم عن طريق القياس الطيفي الشامل. بعد ذلك، تحليل مباشرة جزء من UV مائل متراكب بواسطة قياس الطيف الشامل لتحديد البروتيوم بأكمله من المواد النقية بطريقة غير متحيزة.
في هذه الدراسة، الجذعية حلقة RNA الموسومة مع البيوتين الصورة مشقوق هو محتضن مع 1 ملليلتر من مستخلص S100 السيتوبلازمي التي تم الحصول عليها من خلايا المايلوما الفئران. ويتم تحليل تأثير وكفاءة للأشعة فوق البنفسجية من قبل تلطيخ الفضة. يتم الكشف عن عدد من البروتينات على الخرز streptavidin قبل elution الأشعة فوق البنفسجية.
الإشعاع مع الموجات الطويلة UV تطلق فقط بعض هذه البروتينات في supernatant ترك خلفية غير محددة على الخرز. وهذا يؤكد على أهمية خطوة elution الأشعة فوق البنفسجية. يحدد قياس الطيف الكتلي البروتينات UV المائلة الرئيسية على أنها 3'hExo و SLBP مع SLBP يتم تمثيلها من خلال كل من البروتين الكامل الطول وعدد من منتجات التحلل الأقصر.
كميات أصغر من البروتينات الأخرى التي تم تحديدها كبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي المختلفة التي يتم إطلاقها أيضًا بشكل انتقائي في محلول بواسطة الأشعة فوق البنفسجية. أدى elution من شل الحركة Drosophila histone قبل مرنا الموسومة مع biotin يندمج مع مستخلص نووي إلى إطلاق انتقائي لعدد قليل فقط من البروتينات في السوبر مع خلفية مكثفة من البروتينات غير محددة المتبقية على الخرز. يحدد قياس الطيف الكتلي هذه البروتينات لتكون مكونات U7 snRNP.
لم يتم الكشف عنها في وجود المنافسين معالجة التي كتلة ملزمة من U7 snRNP إلى histone قبل مرنا. من المهم استخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية عالية الكثافة ووضعها على مسافة قريبة من العينة المشععة مع التأكد أيضا من أنها لا ترتفع درجة الحرارة. طريقة elution الأشعة فوق البنفسجية تسفر عن مجمعات البروتين الحمض النووي الريبي الأصلي التي تفتقر إلى الملوثات الرئيسية ومناسبة مباشرة لمزيد من خطوات تنقية والتقديس الوظيفي.
تجنب التعرض للعين والجلد أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة استراتيجية معدلة لتنقية مجمعات الحمض النووي الريبي/البروتين باستخدام رابط قابل للفصل بالضوء وطريقة إزاحة لطيفة بالأشعة فوق البنفسجية. تهدف هذه الطريقة إلى الحصول على مجمعات أصلية ووظيفية بالكامل مناسبة لتحليل إضافي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الكيمياء الحيوية
- علم الأحياء الجزيئي
- بيولوجيا الحمض النووي الريبي
الخلفية
- يمكن أن تعطل طرق التنقية التقليدية مجمعات الحمض النووي الريبي/البروتين.
- غالبًا ما تنتج الاستراتيجيات الحالية مجمعات غير مناسبة للتحليل الوظيفي.
- تقدم الروابط القابلة للفصل بالضوء حلًا محتملًا للإزاحة اللطيفة.
- تكون هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للمجمعات الموجودة بكميات محدودة.
هدف الدراسة
- تحسين تنقية مجمعات الحمض النووي الريبي/البروتين.
- الحفاظ على وظيفة المجمعات بعد التنقية.
- تبسيط عملية التنقية إلى خطوة واحدة.
الطرق المستخدمة
- استخدام رابط قابل للفصل بالضوء في الحمض النووي الريبي.
- خطوة إزاحة لطيفة بالأشعة فوق البنفسجية لإطلاق المجمعات.
- خلط الحمض النووي الريبي مع أوليجونوكليوتيدات المحول في محفز الربط.
- تطبيق تقنية مطيافية الكتلة لتحليل التركيب.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة المعدلة في الحصول على مجمعات الحمض النووي الريبي/البروتين الأصلية.
- تكون عملية التنقية في خطوة واحدة فعالة للمجمعات ذات الأطوال المختلفة.
- تسمح الوظيفة المحفوظة بإجراء تحليل إضافي.
- تم توضيح البروتوكول بواسطة فني بحث كبير.
الاستنتاجات
- تعزز هذه الطريقة عزل مجمعات الحمض النووي الريبي/البروتين.
- تكون مفيدة بشكل خاص للمجمعات التي يصعب تنقيتها.
- يمكن أن تسهل المقاربة الدراسات المستقبلية في بيولوجيا الحمض النووي الريبي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Single-step purification of RNA/protein complexes using RNA attached to biotin via a photo-cleavable linker addresses a critical bottleneck in isolating native macromolecular assemblies for downstream functional and proteomic analysis. This approach enables the recovery of intact complexes free from major contaminants, supporting high-confidence target validation and mechanistic de-risking in early discovery workflows. The method is particularly valuable for complexes present in limited abundance or prone to dissociation during multi-step purification, enhancing portfolio decision-making at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables isolation of native RNA/protein complexes for unbiased composition analysis by mass spectrometry.
- Supports functional interrogation of complexes without denaturation, reducing mechanistic ambiguity.
- Facilitates target validation by providing high-purity complexes suitable for direct functional assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RNA/protein complexes for downstream screening and assay development workflows.
- Improves reproducibility and standardization by minimizing non-specific background proteins.
- Delivers quantitative, contamination-free samples for reliable compound evaluation and assay calibration.
Translational & Preclinical Research
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by preserving native complex integrity.
- Supports translational biomarker identification through mass spectrometry of purified complexes.
- Reduces risk of false negatives in functional studies by maintaining complex activity post-purification.
Pipeline & Workflow Integration
This UV-elution purification method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing native complexes for both mechanistic studies and downstream screening. It is positioned as a reusable capability for isolating diverse RNA/protein assemblies across multiple targets and model systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling native complex recovery.
- Screening: Delivers assay-ready complexes with minimal background for robust screening workflows.
- Analytics: Provides high-quality samples for quantitative mass spectrometry and comparative analysis.
- Translational Research: Maintains biological relevance for preclinical and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various RNA and DNA binding complexes, supporting broad R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows with single-step purification and scalable protocols.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing high-integrity data for early-stage evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling functional and proteomic assessment of candidate complexes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA synthesis, photo-cleavable linker chemistry, and UV handling.
- Needs access to high-intensity UV lamps and mass spectrometry infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and safety during UV exposure.
- Adaptable to both short and long RNA substrates, with protocol variants for each.
- Careful optimization of UV exposure is necessary to prevent sample overheating and ensure efficient elution.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Substrate Preparation
1:28
Complex Assembly
2:14
Immobilization of the RNA/protein Complexes on Streptavidin Beads
4:00
UV-Elution
5:08
Sample Analysis by Silver Staining Followed by Mass Spectrometry
5:59
Results: Analysis of UV-eluted Complexes
7:36
Conclusion
