عزل الخلايا الكيراتينية البشرة الماوس وثقافتهم في المختبر Clonogenic

إن طريقتنا في حصاد خلايا البشرة من الفئران البالغة مفيدة لتطبيقات المصب مثل الخلايا الجذعية الكيراتينوسيت. لدينا تقنية قابلة للاستنساخ للغاية ويمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع إجراءات في الجسم الحي في الفئران في سياق الجلد نموذج مسرطنة. بعد حصاد عينات الجلد الظهرية من الفئران الكبار القتل الرحيم، واستخدام ملقط autoclaved ومشرط لوضع واحد الجلد الظهري في الجانب شعر مرة أسفل في طبق بيتري رقيقة وخردة قبالة الأنسجة تحت الجلد بما في ذلك الدهون من أنسجة الجلد البطني حتى الأنسجة شبه شفافة.

ضع الجلد المكشط في برنامج تلفزيوني حتى تتم معالجة جميع الجلود المتبقية الأخرى. ثم استخدم مشرط لشريحة عينات الجلد إلى 0.5 من قبل واحد إلى 1.5 شرائط سنتيمتر. وضع شرائح الجانب شعر حتى في طبق بيتري العقيمة قبل تعويم العينات الجانب شعر حتى على سطح برنامج تلفزيوني 20 ملليلتر بالإضافة إلى اثنين من الحل gentamicin x, تكمل مع 0.25٪ التربسين في البلاستيك 100 في 20 ملليمتر طبق بيتري لمدة ساعتين في 32 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة، ضع طبق بيتري معقمة، بلاستيكية، مربعة تحتوي على 15 ملليلتر من متوسط الحصاد في منحدر 30 درجة واستخدام ملقط منحنية لنقل بعناية شريط الجلد العائمة في الطبق. عقد شفرة مشرط جديدة في زاوية عمودي على الجلد واستخدام قوة كافية ولكن ليست مفرطة، والخردة قبالة البشرة والشعر من العينة إلى المتوسطة. عندما تم كشط جميع الشرائط، بعناية decant الخلية البشرة التي تحتوي على عظمى في جرة 60 ملليلتر العقيمة التي تحتوي على شريط 1.5 بوصة يحرك المغناطيسي وشطف طبق بيتري مع متوسطة الحصاد إضافية لجمع أي خلايا البشرة المتبقية.

جلب حجم النهائي في جرة إلى 30 ملليلتر مع المتوسطة الطازجة، ويحرك حل خلية البشرة في 100 دوران في الدقيقة الواحدة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة اثارة في مجلس الوزراء السلامة الحيوية إزالة شريط اثارة وتصفية حل الخلية من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. استخدام ملقط ومن ثم ماصة للضغط على الشعر والمواد القرنية الطبقة من خلال مصفاة للتلاعب الأنسجة لإطلاق سراح خلايا الشعر المحاصرين واستخدام خمسة ملليلتر إضافية من حصاد المتوسطة لإطلاق خلايا الشعر المتبقية المحاصرين في الأنبوب.

من المهم أن يتم التلاعب بالخلايا البشرة والشعر وذلك لتحرير الخلايا من بصيلات الشعر. جلب الحجم الإجمالي في أنبوب يصل إلى 50 ملليلتر مع المتوسطة الطازجة وجمع الترشيح الخلية عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في 5 ملليلتر من حصاد المتوسطة الطازجة في حوالي 20 triturations مع ماصة 5 ملليلتر.

تأخذ 0.5 ملليلتر من واحد إلى 20 تخفيف ونقلها إلى أنبوب ميكروفروج 2 ملليلتر. بعد خلط العينة بعناية، واتخاذ 200 ميكرولترات من أنبوب microfuge ومزيج بلطف مع حجم متساو من 0.4٪ trypan حل الأزرق. خلط بلطف هذا الحل ثلاث مرات ونقل الخلايا إلى هاموسيتاتوميمتر لعد الخلايا الكيراتينية النووية.

تسجيل جميع الخلايا الزرقاء الداكنة كخلايا غير قابلة للحياة وتسجيل الذهب الصغيرة والخلايا الوردية كخلايا قابلة للحياة. متوسطات قابلية البقاء حوالي 80٪ وينبغي أن يكون العائد النهائي للكيراتينوسيت لكل فأر حوالي 30 مليون خلية قابلة للحياة. بعد العد، وجمع الخلايا مع طرد مركز آخر، ولثقافة الشامل resuspend 2-4 مرات 10 إلى سادس قابل للحياة keratinocytes لكل 35 ملليمتر طبق بيتري في 2 ملليلتر من خلية ثقافة المتوسطة.

لفرز القولون clonogenic، resuspend الخلايا في مرة واحدة 10 إلى keratinocytes الثالثة لكل أربعة ملليلتر من تعديل وليام E المتوسطة مع ملاحق في تركيز المصل لكل الكولاجين المغلفة 60 ملليمتر طبق بيتري على الأشعة السينية شعاع الماوس السويسري 3T3 طبقات التغذية. للثقافة الجماهيرية، تنمو الثقافات في 32 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لفترة مناسبة ثقافة الخلية. تغيير المتوسط 24 ساعة بعد البذر الأولي للثقافة الجماهيرية وثلاث مرات في الأسبوع بعد ذلك.

في نهاية الثقافة التخفي التعرق المتوسطة وإصلاح المستعمرات في 10٪ buffered formalin خلال الليل في درجة حرارة الغرفة. في صباح اليوم التالي، وصمة عار المستعمرات مع 0.5٪ rhodamine B في الماء autoclaved لمدة ساعة واحدة، قبل شطف الأطباق في الماء البارد autoclaved حتى المياه يعمل واضحة. ثم تميل الأطباق على أغطية لتجف قبل عد المستعمرات.

هنا, تظهر نتائج نموذجية من تشكيل القولون keratinocyte بعد العلاجات الموضعية المختلفة. الخلايا الجذعية بصيلات الشعر عادة ما تشكل ما يقرب من 9٪ من الخلايا المعزولة من الجلد دورسال C57BL/6 ماوس بالغ كما تم تقييمها بواسطة تلطيخ تدفق الخلايا الخلوية لعلامات الخلايا الجذعية بصيلات الشعر الماوس. في هذا الرقم يمكن ملاحظة خصائص النمو من مستعمرات الخلايا الجذعية keratinocyte بعد الثقافة في ظل أربعة ظروف متوسطة مختلفة.

بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام الخلايا لعملية استئصال الخلايا المتدفقة، وفرز الخلايا المنشطة بالفلور، واستزراع الخلايا، والتحليلات البيولوجية الجزيئية. وقد مكنتنا هذه التقنية من تحديد أن عدد الخلايا الجذعية البشرة هو سمة كمية ومعقدة تؤدي إلى تحديد جين تنظيمي جديد للخلايا الجذعية.