Name: مقايسة نقل رودوبسين بتحليل التصوير عالية-المحتوى (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: تعلم تقنية التصوير عالي المحتوى لقياس نقل رودوبسين المرتبط بمرض التنكس الشبكي الصباغي. تُستخدم هذه الطريقة لتحليل توطين البروتين على سطح الخلية وتقييم آثار الأدوية بسرعة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونشكر الدكتور مارك شورداك هاء، واكتشاف المخدرات جامعة بيتسبرغ معهد توفير تصوير محتوى عالية والتدريبات الأولية. سخاء يشارك الدكتور كريستوف بالكزيوسكي (حالة جامعة Western Reserve) 4 1 و B630 رودوبسين المضادة الأجسام المضادة. وشاطره بلازميد يحتوي على كدنا من الماوس رودوبسين-فينوس بناء الدكتور نيفين لامبرت (أوغوستا جامعة). وأيد هذا العمل المعهد الوطني للصحة منحة EY024992 للبطاقة الصفراء و P30EY008098 من منحة جامعة بيتسبرغ الرؤية الأساسية للبحث.

<ol><li>Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).</li>
<li>Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+on+genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).</li>
<li>Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).</li>
<li>Stenson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Gene+Mutation+Database%3A+towards+a+comprehensive+repository+of+inherited+mutation+data+for+medical+research%2C+genetic+diagnosis+and+next-generation+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies.</a> Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).</li>
<li>Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mutant+rhodopsins+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).</li>
<li>Athanasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+reveals+potential+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).</li>
<li>Chiang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Endoplasmic+Reticulum-Associated+Degradation+of+Rhodopsin+Precedes+Retinal+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration.</a> Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).</li>
<li>Sakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mechanisms+of+photoreceptor+degeneration+in+a+new+mouse+model+of+the+common+form+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+due+to+P23H+opsin+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).</li>
<li>Dryja, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+rhodopsin+gene+in+patients+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).</li>
<li>Sohocki, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+mutations+causing+retinitis+pigmentosa+and+other+inherited+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies.</a> Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+molecule+chaperone+of+rod+opsin+and+its+potential+therapy+for+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration.</a> Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).</li>
<li>Chen, Y., Tang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assays+to+identify+small+molecules+preventing+photoreceptor+degeneration+caused+by+the+rhodopsin+P23H+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation.</a> Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Drug+Screening+Strategy+for+Detecting+Rhodopsin+P23H+Mutant+Rescue+and+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).</li>
<li>Noorwez, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+chaperone-mediated+in+vivo+folding+and+stabilization+of+the+P23H-opsin+mutant+associated+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).</li>
<li>Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+fate+of+mutant+rhodopsin%3A+quality+control%2C+degradation+and+aggresome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation.</a> Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).</li>
<li>Kaushal, S., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+in+rhodopsin.+7.+Point+mutations+associated+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).</li>
<li>Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+NIH3T3+cell+lines+expressing+opsin+and+the+P23H+opsin+mutant+identifies+candidate+drugs+for+the+treatment+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa.</a> Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).</li>
<li>Adamus, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-rhodopsin+monoclonal+antibodies+of+defined+specificity%3A+characterization+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application.</a> Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).</li>
<li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBray%2C+MA+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+mutations+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.+Clustering+of+functional+classes+along+the+polypeptide+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).</li>
<li>Krebs, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+and+the+efficacy+of+pharmacological+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

هنا، واظهرنا مقايسة تصوير عالية المحتوى المستخدمة لوصف عدد الزيارات المحددة من HTS. أتمتة فقط المشاركة في هذه البروتوكولات هو تصوير عالية-المحتوى. استخدمت إيمونوستاينينج وتصوير الأسفار من رهودوبسن في عادة لوصف توطين رودوبسين5،14،،من1516. إلا أن التحديد الكمي للصور الملتقطة بأساليب التصوير التقليدية محدودة بسبب عدم كافية صور الخلية الواحدة شرط، القدرة المنخفضة للصور للتجربة، وعدم وجود معامل مراق...

ويشارك misfolding البروتين في ضمور العضلات، تنكسات العصبية، فضلا عن الأمراض المسببة للعمى، بما في ذلك التهاب الشبكية الصباغي (RP)1. RP تنكس شبكية الموروثة والتدريجي المرتبطة بطفرات في ما يزيد على 60 من الجينات التي تؤثر على وظيفة والتوازن photoreceptors رود أو2،ابيثيليومس المصطبغة الشبكية (الرؤى)3. لا يوجد علاج فعال متوفر حاليا للبرنامج العادي. رودوبسين الطفرات تستأثر بحوالي 25-30% من جسمي المهيمنة (ad) الحالات RP. من بين أكثر من 150 رودوبسين الطفرات4 (الجينات البشرية الطفرة قاعدة، http:/www.hgmd.cf.ac.uk/)، تسبب طفرات "الفئة الثانية" عدم الاستقرار الهيكلي من البروتين رودوبسين يسهم في وفاة مستقبله رود و رؤية فقدان5،6،،من78. P23H هو طفرة رودوبسين الأكثر شيوعاً في أمريكا الشمالية، وأيضا مثال نموذجي "الفئة الثانية" رودوبسين الطفرات9،10. سبب في عدم الاستقرار الهيكلي الكامن، تراكمت رودوبسين تجمعات في هيولى (ER) في خلايا الثدييات، بينما يقع رودوبسين نوع البرية على غشاء البلازما5. رودوبسين تجمعات P23H المعارض متحولة المهيمنة سيتوتوكسيسيتي السلبية التي ليس بسبب هابلوينسوفيسينسي، ولكنه يرتبط بتنشيط ER المرتبطة مسار تدهور البروتين وتنظيم الجزء الخارجي قضبان تمت مقاطعتها. للتخفيف من حدة الإجهاد خلية مستقبله رود، استراتيجية واحدة لتحقيق استقرار الطي أصلي من رهودوبسن متحولة كوصي دوائية باستخدام.
ولتحقيق هذا الهدف، أجرينا12،11،شاشة الفائق المستندة إلى الخلية (هتس)13 استخدام مقايسة تكامل يفتت β-جالاكتوسيداسي للتحديد الكمي للمسخ رودوبسين P23H تنقل على البلازما غشاء. البروتوكول بسيطة وقوية لهذا الإنزيم HTS مكنتنا من استكشاف أنشطة حوالي 79,000 الجزيئات الصغيرة لكل شاشة. ومع ذلك، نظراً لأن هذا الإنزيم HTS يقرأ إشارات التﻷلؤ، المغلوطة بما في ذلك مثبطات بيتا-غال، المركبات الملونة أو السامة للخلايا مدرجة في قائمة انتظار التي تحددها تحليل ثانوي.
إيمونوستينينج التقليدية وأساليب التصوير fluorescence استخدمت لسنوات لدراسة النقل رودوبسين في خلايا الثدييات5،14،،من1516. ومع ذلك، لا يمكن استخدام هذه الأساليب التقليدية لقياس التأثيرات الدوائية أكثر من 10 مركبات نحو النقل رودوبسين لأنه يتطلب إجراء تحليل تصوير موثوق بها عدد كبير من الصور التي اتخذت تحت شرط متسقة عالية، لا تنظيمي بأساليب التصوير التقليدية. هنا، وضعنا بروتوكولا تصوير إيمونوستينينج على أساس محتوى عالية كتحليل ثانوي التحديد الكمي للنقل البري والبحري في خلية رودوبسين تجمعات طفرات11،،من1317. لتسمية رودوبسين في غشاء البلازما، علينا تخطي الخطوة permeabilization غشاء الخلايا وإيمونوستاينيد طفرات رودوبسين من رهودوبسن المضادة (B6-30) [مونوكلونل] الاعتراف حانمه الطرفي ن من رهودوبسن في الجانب خارج الخلية للخلية غشاء18. تصور رودوبسين المسخ في الخلية كلها، نحن تنصهر رودوبسين مع البروتين fluorescence فينوس. بالتحديد الكمي كثافات الأسفار في الأسفار مختلف القنوات، نحن قادرون على الحصول على معلمات متعددة من تجربة واحدة واحدة، بما في ذلك كثافة رودوبسين المجموع في الخلية كلها، على سطح الخلية، ونسبة رودوبسين الأسفار على سطح الخلية لأن في كل خلية. تطبيق هذا الأسلوب باستقرار الخلايا معربا عن ما مجموعة ستة تجمعات رودوبسين طفرات، أننا يمكن أن تولد لمحة دوائية لمرافقين جزيء صغيرة متعددة تجاه هذه المسوخ. في هذا البروتوكول، كافة الخلايا إيمونوستينيد في صفيحة 384-جيدا وتصويرها باستخدام نظام تصوير تحت شرط تصوير عالية متسقة. يتم إجراء تحليل صورة لكل بئر، التي تحتوي على صور لأكثر من 600 من الخلايا لتقليل التباين بسبب عدم تجانس الخلايا مع تفاوت مستوى التعبير الشكل والبروتين في الخلية. ويرد في الشكل 1سير العمل لهذا البروتوكول. وميزة هذا الأسلوب أن نحصل على صور عالية الدقة، فضلا عن كوانتيفيكيشنز معلمة متعددة من التحليل القائم على الصورة. بشكل عام، يمكن تعديل هذا البروتوكول وتطبيق على التحديد الكمي لنقل أي بروتين غشائي تجمعات للفائدة.

<table><tbody><tr><td>خلايا U2OS (رودوبسين-فينوس)</td><td>NA</td><td></td> NA <td>الخلايا المستقرة التي تم إنشاؤها من خلايا U2OS</td></tr><tr><td>(T4R-rhodopsin-Venus) خلايا</td><td>NA</td><td></td> NA <td>الخلايا المستقرة التي تم إنشاؤها من خلايا U2OS</td></tr><tr><td>(P23H-rhodopsin-Venus) خلايا</td><td>NA</td><td></td> NA الخلايا <td>المستقرة التي تم إنشاؤها من خلايا U2OS</td></tr><tr><td>(P53R-rhodopsin-Venus)</td><td>خلايا NA</td><td></td> NA الخلايا <td>المستقرة التي تم إنشاؤها من خلايا U2OS</td></tr><tr><td>خلايا U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus)</td><td>NA</td><td></td> NA <td>خلايا مستقرة تم إنشاؤها من خلايا U2OS</td></tr><tr><td>(D190N-rhodopsin-Venus) خلايا U2OS (D190N-rhodopsin-Venus)</td> خلايا <td>NA</td><td></td> NA الخلايا <td>المستقرة المتولدة من خلايا</td></tr><tr><td>U2OS (P267L-rhodopsin-Venus)</td> خلايا <td>NA</td><td>NA</td><td>الخلايا المستقرة المتولدة من خلايا U2OS</td></tr><tr><td>DMEM نسبة الجلوكوز العالية</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>مع L-Glutamine والصوديوم مصل البيروفات</td></tr><tr><td>الأبقار الجنينية (FBS)</td><td>جيبكو</td><td>16140071</td><td>البلازما المعطلة بالحرارة</td></tr><tr><td></td><td>InvivoGen</td><td>كاشف القضاء على الميكوبلازما</td><td>النمل</td></tr><tr><td>MPT البنسلين ستربتومايسين (100X)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100X محاليل مضاد حيوي مركزة لمنع تلوث البكتيريا من مزارع الخلايا</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td>0.25٪ ، 1 ملي مولار EDTA في HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم</td></tr><tr><td>محلول بولي إل ليسين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P4707-50ML</td><td>مول بالوزن 70،000-150،000 ، 0.01٪ ، معقم مفلتر ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا</td></tr><tr><td>CellCarrier-384 Ultra Microplates</td><td>PerkinElmer</td><td>6057300</td><td>384 بئر الأنسجة المعالجة بألواح مجهرية مع جدران بئر سوداء وقاع أوليفين دوري واضح بصريا لتصوير الخلايا في تحليل</td></tr> <tr><td>المحتوى العاليصفيحة معقمة ذات 96 بئر</td><td>Eppendorf</td><td>30730119</td><td>زراعة الأنسجة المعالجة بغطاء مسطح القاع ، معقم ، خالي من البيروجينات التي يمكن اكتشافها ، الرناس ، DNase والحمض النووي. </td></tr> الفوسفات غير السام <tr><td>للخلايا Sailine Buffered (PBS)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>10 × PBS Buffer ، درجة الحموضة 7.4</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>>99.5٪ ، تم اختبار ثقافة الخلايا</td></tr><tr><td>9-cis-شبكية</td> العين <td>Sigma-Aldrich</td><td>R5754</td><td></td></tr><tr><td>تم اختبار المركبات</td><td>Selleckchem / Life Chemicals / مركبات NA المركبة</td><td></td><td>المخصصة من تم شراؤها من بائعون مختلفون أو</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة المضادة للرودوبسين B6-30</td> المركبة <td>خصيصا Novus</td><td>NBP2-25160</td><td>هدية من الدكتور Krzysztof Palczewski</td></tr><tr><td>Cy3 المترافق مع الماعز المضاد للجسم المضاد الثانوي لمختبرات</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories،</td><td>Inc 115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>16٪ بارافورمالدهايد</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>خالي من الميثانول</td></tr><tr><td>10٪ مصل الماعز العادي</td><td>الحراري Fisher Scientific</td><td>50062Z</td><td>Blocking buffer</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 ، Trihydroch</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>محلول تلطيخ نووي</td></tr><tr>جهاز<td>تصوير عالي المحتوى</td><td>أجهزة جزيئية</td><td>ImageXpress</td><td>ImageXpress & reg ؛ نظام التصوير الجزئي متحد البؤر عالي المحتوى</td></tr><tr><td>MetaXpress برنامج الحصول على الصور عالية المحتوى وتحليلها</td><td>الأجهزة الجزيئية</td><td>MetaXpress</td><td>برنامج الحصول على الصور وتحليلها عالي المحتوى</td></tr><tr><td>ماصة متعددة القنوات (0.5-10 & micro; L)</td> <td>ماصة Rainin</td><td>17013802</td><td>يدوية ذات 8 قنوات ، 0.5-10 وميكرو ؛ L</td></tr><tr><td>ماصة متعددة القنوات (0.5-10c</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td>ماصة يدوية ذات 8 قنوات ، 20-200 وميكرو ؛ L</td></tr><tr><td>ماصة إلكترونية متعددة القنوات (10-200 مو ؛ L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>14-3879-56BT</td><td>ماصة إلكترونية متعددة القنوات لمهام ماصة 96 و 384 بئر ماصة صفيحة دقيقة</td></tr><tr><td>50 مل كاشف خزان</td><td>جينيسي العلمي</td><td>28-125</td><td>كاشف احتياطي للشفاط متعدد القنوات الاستغناء</td></tr> عن <tr><td>شفاط 8 قنوات</td><td>ABC Scientific</td><td>EV503</td><td>محول من الفولاذ المقاوم للصدأ 8 قنوات لشفط السوائل من ألواح 96 أو 384 بئرا</td></tr><tr><td>Excel برنامج جداول البيانات</td><td>Microsoft</td><td>Excel2016</td><td>برنامج جداول البيانات لتحليل البيانات وإنشاء خريطة التمثيل اللوني</td></tr><tr><td>Origin2018 برنامج تحليل البيانات العلمية والرسوم البيانية</td><td>OriginLab</td><td>Origin2018</td><td>برنامج تحليل البيانات لإنشاء منحنيات استجابة الجرعة</td></tr></tbody></table>

مقايسة نقل رودوبسين بتحليل التصوير عالية-المحتوى

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

رودوبسين misfolding الطفرات تؤدي إلى وفاة مستقبله رود أن يتجلى جسمية مهيمنة التهاب الشبكية الصباغي (RP)، متدرجة المسببة للعمى المرض الذي يفتقر إلى العلاج الفعال. نحن افترض أن سيتوتوكسيسيتي متحولة رودوبسين تجمعات يمكن تخفيفها باستقرار عقاقيري البروتين رودوبسين المسخ. الطفرة P23H، بين الطفرات رودوبسين "الثاني فئة" أخرى، يشفر بروتين متحولة رودوبسين هيكلياً غير مستقرة التي تراكمت في هيولى (ER)، بينما رودوبسين نوع البرية تنقل إلى غشاء البلازما في الثدييات الخلايا. نحن سابقا أداء شاشة الفائق على أساس التﻷلؤ (HTS)، وحددت مجموعة من مرافقين الدوائية التي أنقذت بنقل رودوبسين P23H من ER لغشاء البلازما. هنا، باستخدام أسلوب immunostaining متبوعة بتحليل تصوير عالية المحتوى، نحن كمياً مقدار البروتين رودوبسين المسخ في الخلية كلها وفي غشاء البلازما. هذه الطريقة مفيدة وفعالة لتحديد الزيارات الحقيقية من إيجابيات كاذبة عقب HTS. بالإضافة إلى ذلك، تحليل صورة عالية--محتوى مكنتنا من تحديد معلمات متعددة من تجربة واحدة لتقييم الخصائص الدوائية لكل مجمع. باستخدام هذا الفحص، قمنا بتحليل تأثير مركبات مختلفة 11 نحو ستة طفرات رودوبسين RP المرتبطة، الحصول على ملف تعريف دوائية 2-د لفهم الكمية والنوعية عن الاستقرار الهيكلي لهذه المسوخ رودوبسين وفعالية مركبات مختلفة تجاه هذه المسوخ.

نحن تتميز بنقل رودوبسين مع المعلمات الثلاث: كثافة رودوبسين-فينوس في الخلية كاملة (INT رودوبسين-فينوس)، كثافة immunostaining رودوبسين في غشاء البلازما (INT رودوبسين على سطح الخلية)، والنسبة رودوبسين وصمة عار على سطح الخلية لكثافة رودوبسين-فينوس في الخلية كاملة (MEM-إجمالي نسبة). ممثل نتيجة الفحص النقل رودوبسين يرد في الشكل 3 و 4 الشكل. استخدام [دمس] و 9-رابطة الدول المستقلة-الشبكية تعامل الخلايا معربا عن P23H-رودوبسين-فين...

هنا، يمكننا وصف أسلوب تصوير عالية المحتوى التحديد الكمي لنقل طفرات رودوبسين المرتبطة بالتهاب الشبكية الصباغي. تحليل سجل متعددة-الطول الموجي استخدمت لتحديد كمية البروتين رودوبسين على سطح الخلية أو في الخلية كلها.

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

يسبب التطويل الخاطئ للرودودبسين انحطاط الشبكية التدريجي الذي يسمى التهاب الشبكية الصباغي. في حين أن طريقة التصوير التقليدية لديها قدرة محدودة على قياس نقل الرودوبسين ، فإن هذا الفحص القائم على الصور المطور حديثًا يسمح بالفحص عالي الإنتاجية ، مما يزيل الإيجابيات الكاذبة. هذه التقنية تسمح لتقييم سريع للدوائية المخدرات.في عين إنقاذ للطي من rhodopsin المسببة للأمراض ، وبالتالي تسريع إمكانية علاج مرض لا يمكن علاجه بهدوء والعمى ، التهاب الأذن الصباغي. توطين الخلوية من البروتين غشاء مهم جدا لوظيفته. ويمكن تعديل هذه الطريقة بسهولة وتطبيقها لتحديد كمية نقل أي بروتين غشاء آخر من الفائدة.تأكد من إعداد خريطة لوحة وإضافة بلطف وpirate السائل من كل بئر من لوحة، للحفاظ على عدد الخلايا والحالة المناعية الظروف متسقة بين الخلايا. وهذا سوف تسفر عن عامل Z عالية، ونتائج موثوق بها. للبدء، بذور 5000 الخلايا في بئر في أسود مسورة، أسفل واضحة، بولي lysine تعامل 384-جيدا لوحة.احتضان لوحة في 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات لخلايا نعلق على الجزء السفلي من لوحة. بعد ذلك ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 10 ميكروليترز لكل بئر من حلول العمل 5X ، وفقًا لخريطة لوحة محددة مسبقًا مثل تلك الموضحة هنا. الآن، إضافة 10 ميكرولترات لكل بئر من 2٪ DMSO إلى العمودين 22 و 24.أيضا، إضافة 10 ميكرولترات لكل بئر من 25 ميكرومولار 9-cis-شبكية العين إلى العمود 23 في غرفة مظلمة تحت الضوء الأحمر خافت. عند الانتهاء من تحميل جميع مركبات الاختبار المختلفة، قم بتغطية اللوحة بورق الألومنيوم، واحتضانها عند درجة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. أخرج اللوح 384-جيدا في غرفة مظلمة مع ضوء أحمر خافت.هنا، باستخدام 8 قنوات- التعرق، متصلة بزجاجة جمع فراغ، لpirate لطيف المتوسطة من آبار لوحة. بعد ذلك ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 20 ميكرولترات لكل بئر من 4٪ Paraformaldehyde الطازجة إلى لوحة 384-well بأكملها ، وإصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت، ضع اللوحة في الضوء العادي.هناك، استخدام 8-قناة- التعرق، لpirpirate Paraformaldehyde في كل بئر، واستخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولترات لكل بئر من برنامج تلفزيوني. التعرق واستبدال برنامج تلفزيوني لما مجموعه ثلاث دورات الغسيل. ثم، إضافة 20 ميكرولترات لكل بئر من مصل الماعز 5٪ إلى كل بئر، واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.بعد الحضانة، الطامح الآبار، وإضافة 15 ميكرولترات من 20 ميكروغرام لكل ملليلتر B630 المضادة للرودpsين، في مصل الماعز 1٪ إلى الآبار في الصفوف A إلى O.Next، إضافة 15 ميكرولترات لكل بئر من مصل الماعز 1٪ إلى الصف P لمجموعة التحكم في الأجسام المضادة الثانوية فقط. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة، أو في أربع درجات مئوية خلال الليل. ثم، تغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم لتجنب photobleaching من الفلوروفوريس.بعد ذلك ، اغسل اللوحة ثلاث مرات مع 50 ميكرولترات لكل بئر من PBS. بعد الغسيل الأخير ، يُفطن برنامج تلفزيوني ، وأضيف 15 ميكرولتر لكل بئر من خمسة ميكروجرام لكل ملليلتر من الأجسام المضادة IgG المضادة للماعز Cy3-مترافق. تغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.بعد الحضانة، اغسل الطبق ثلاث مرات. ثم، إضافة 50 ميكرولتررس في بئر من برنامج تلفزيوني، تحتوي على ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من وصمة عار Hoechst في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وأخيرا، ختم لوحة البئر مع فيلم شفاف، وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم، وتخزينها في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.إزالة احباط ووضع لوحة عينة في صورة عالية المحتوى، مع A1 وضع في الزاوية اليسرى العليا من لوحة. بعد ذلك، افتح برنامج الحصول على الصور لإعداد المعلمات للحصول على الصور. افتح إطار إعداد اللوحة وإنشاء إعداد جديد أو قم بتحميل ملف إعداد موجود.حدد الهدف 20X وإعداد البيكسل binning كاثنين، وبالتالي فإن حجم بكسل معايرة هو 0.80 في 0.80 ميكرون. ثم، تعيين خطوط المسح الضوئي كـ 2000، وحجم الصورة 1000 في 1000 بكسل لكل موقع. بعد ذلك، حدد نوع اللوحة ليتم تصويرها.استخدم المعلومات التي توفرها الشركة المصنعة لملء أبعاد اللوحة. الآن، حدد الآبار التي سيتم تصويرها مع أربعة مواقع ليتم تصويرها في البئر. تجنب الجانب من البئر، والتي لمست من قبل نصائح الطموح.للتصوير، حدد أشعة الليزر الإثارة ك 405 و 488 و 461 نانومتر. ثم حدد مرشحات الانبعاثات للقنوات DAPI و FITC و تكساس ريد. تحسين قوة الليزر والمكاسب من كل قناة، لضمان، وآبار التحكم الإيجابية ليست مشبعة.حدد جيدا إلى التركيز بشكل جيد للتركيز التلقائي. ثم حدد البئر الأولي الذي سيتم الحصول عليه، ثم قم بتعيين التركيز التلقائي للموقع لكافة المواقع. أيضاً، حدد أربعة متوسطات لكل خط لكل قناة، وقم بتحسين قيمة إزاحة Z لكل قناة.التحقق من صحة، أن كل شيء تم إعداده بشكل صحيح، من خلال اختبار أول اثنين إلى ثلاثة آبار في زوايا اللوحة، للتأكد من الصور هي على التركيز على جميع الآبار اختبارها. بعد ذلك ، تحقق ، أن الصور من جميع المواقع في كل بئر لديها خلايا مع أكثر من 40 ٪ التقاء. وأخيرا، تحقق، أن كثافة الفلوريسين في جميع القنوات كلها حوالي نصف المشبعة في 100٪ السيطرة الآبار.ثم، حفظ طريقة الحصول على الصورة، وتشغيل لوحة بأكملها. شاهد المصوّر حتى ينتهي من التقاط الصور من العمود الأول من اللوحة للتحقق من جودة الصورة قبل مغادرة المصور. عند الانتهاء، قم بإزالة اللوحة وتخزينها عند أربع درجات مئوية للاستخدام في المستقبل.سحب بيانات الصورة، وذلك باستخدام برنامج تحليل الصور عالية المحتوى. حدد أحد آبار التحكم بنسبة 100٪ في العمود 23 لإعداد المعلمات. أولاً، حدد الخلية الطول الموجي المتعددة كطريقة التحليل، وابدأ في تكوين الإعدادات الإضافية.تعريف النوى باستخدام الصور من قناة DAPI. معاينة، للتأكد من الأشكال النوى المحددة في اختيار جيد يناسب بشكل جيد مع الصور النووية. بعد ذلك، حدد شكل الخلية في قناة FITC، حيث يتم تصوير Rhodopsin Venus.لتحقيق ذلك ، قم بإعداد أقطار الحد الأدنى والحد الأقصى لكل خلية ، والحد الأدنى من كثافة الفلوروس فوق الخلفية ، وكذلك الحد الأدنى من المساحة لكل خلية. الآن، تحديد مناطق بقعة سطح الخلية rhodopsin في قناة تكساس الأحمر، من خلال إعداد أقطار الحد الأدنى والحد الأقصى من شكل الخلية، وكثافة الفلوريوم صغيرة فوق الخلفية، فضلا عن الحد الأدنى من مساحة كل خلية ملطخة. اختبار الخوارزمية الحالية في خمسة آبار لتحديد ما إذا كانت الإعدادات هي الأمثل.ثم احفظ الإعدادات وقم بإغلاق إطار التكوين. تشغيل جميع الآبار مع طريقة تحليل محسنة. عند الانتهاء، قم بتصدير رقم الكائن كرقم الخلية السليم.تصدير متوسط كثافة قناة FITC كما كثافة الزهرة رودpsين، وتصدير متوسط كثافة القناة الحمراء تكساس كما شده رودpsسين على سطح الخلية. استخدم برنامج جدول البيانات لإنشاء خريطة حرارية بلونين لكل معلمة. ترتيب اسم خطوط الخلية على المحور س، والمركبات على المحور ص.هنا، صورنا من P23H rhodopsin فينوس علاج خلايا U2OS، معربا عن الفلورانس فينوس باللون الأخضر، وسطح الخلية مناعية تلطيخ باللون الأحمر. أما الخلايا التي عولجت مع DMSO أو خمسة ميكرومولار 9-cis-retinal. يُظهر مقايسة نقل الرودودبسين، التي تقارن كمية الرودودبسين في الخلية بأكملها في ظل ظروف مختلفة، انتعاشًا كبيرًا في خط الخلية المتحولة P23H، عند معالجتها بـ 9-cis-retinal.بالإضافة إلى ذلك ، فإن شدة الرودوبيسين على سطح الخلية ، ونسبة وصمة رودوبسين على سطح الخلية إلى شدة الزهرة الرودوبين في الخلية بأكملها ، ليست أقل بكثير بالنسبة لـ P23H المتحول ، مقارنة بالنمط البري rhodopsin المعالج بـ DMSO. خريطة الحرارة هي وسيلة فعالة لمقارنة متوسط كمية rhodopsin والتعريب لكل خلية عبر المسوخ متعددة. هنا ، يتم سرد عناصر تحكم النمط البري وستة طفرات رودوبسين أفقيًا ، ويتم مقارنة آثار العلاجات المركبة عموديًا.في الاتفاق مع الدراسات السابقة، وكثافة الرودوبين على سطح الخلية ونسبة وصمة رودوبسين على سطح الخلية إلى شدة الزهرة رودوبسين هي أقل بالنسبة للطفرات الستة مقارنة مع النمط البري تعامل مع DMSO. وزادت المركبات واحد واثنين وستة وتسعة بشكل كبير نسبة وصمة رودوبسين على سطح الخلية إلى كثافة الزهرة الرودوبين في T4R، P23H، D190N، وP267L طفرات rhodopsin، مما يشير إلى أن هذه المركبات إنقاذ نقل هذه المسوخ rhodopsin إلى غشاء البلازما. ضع في اعتبارك أن الخلايا يجب أن تكون بين 50 و 70٪ من الالتقاء قبل التثبيت ، لأن هذا أمر بالغ الأهمية لتحليل الصور.أيضا، أظهرنا صورا لآبار عبر اللوحة بأكملها. تأكد من أن الصور في التركيز ، وأن الفلوريسنس ، التي لا تخرج ، لديها كل قيمة العتبة لأي قناة. ما يصل إلى تحديد المركبات، التي إنقاذ نقل rhodopsin misfolded، يمكننا التحقق من صحة هذه العملية، ثم تمرير فعالية هذه المركبات في الجسم الحي، وذلك باستخدام نموذج الماوس التعبير عن متحولة رودوpsين P23H.هذه الطريقة تسمح لنا لتحديد كمية البروتين الغشاء، وتوطينه. ولذلك، بل هو أداة عظيمة لخطأ الجزئي بدأت على البروتين غشاء في مساعدة حفظ وتدهور. وفيما يتعلق بالمكافات شبه العسكرية، كما هو الحال في هذه التجربة، فإن له إجراءات تنطوي على معالجة هذا الكاشف.سيتم ذلك تحت غطاء محرك السيارة. وينبغي التخلص من النفايات بما فيها هذا الكاشف كما ينبغي التخلص منها كمادة كيميائية خطرة.

a-rhodopsin-transport-assay-by-high-content-imaging-analysis

Research

JoVE Journal

Chemistry

الكيمياء

نحن تصف منهجية الجمع الآلي زراعة الخلايا على درجة عالية من المحتوى التصوير لتصور وتحديد العمليات الخلوية وهياكل متعددة ، بطريقة عالية الإنتاجية. يمكن أن تساعد في مثل هذه الأساليب الفنية الشرح مزيد من الجينوم فضلا عن تحديد شبكات الجينات المرض والمخدرات الأهداف المحتملة.

فحص محتوى عالية في أمراض الاعصاب

وصفنا بروتوكول لمراقبة كا 2+ ديناميكية في محطات محوار مبصرات مخروط باستخدام إعداد شريحة فيفو السابقين في شبكية العين الماوس. هذا البروتوكول يسمح دراسات شاملة للمخروط الكالسيوم 2+ الإشارات في نظام المهم نموذج الثدييات، والفأر.

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

وTMEM184A ترميز بناء مع علامة GFP في-محطة كربوكسي مصممة للتعبير حقيقية النواة، كان يعمل في فحوصات تهدف إلى التأكد من تحديد TMEM184A بمثابة مستقبلات الهيبارين في خلايا الأوعية الدموية.

باستخدام TMEM184A GFP الموسومة نبني لتأكيد الهيبارين مستقبلات الهوية

نقدم ارتفاع محتواها أداة مفتوحة المصدر تحليل (HCA) باستخدام آلية التصوير مضان عمر (FLIM) لمعايرة تفاعلات البروتين باستخدام فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) قراءات مقرها. يتم التحكم والحصول على البيانات لهذا الصك openFLIM-HCA من قبل البرامج المكتوبة في μManager وإجراء تحليل البيانات في FLIMfit.

المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري

تقدم هذه الورقة سير العمل المجهري عالية المحتوى لتحديد الكمي في وقت واحد من مستويات روس داخل الخلايا، فضلا عن إمكانات الغشاء الميتوكوندريا والمورفولوجيا - يشار إليها مجتمعة باسم مورفوفونكتيون الميتوكوندريا - في الخلايا الملتصقة الحية باستخدام الخلايا الخلوية جزيئات مراسل الفلورسنت 5- 6) -كلوروميثيل -2 '، 7'- ثنائي كلورودي هيدروفلورسئين دياسيتات، استر أستيل (سم-H 2 دسفدا) وتيتراميثيلرودامين ميثيلستر (تمرم).

الخلوية الأكسدة التنميط باستخدام عالية المحتوى المجهري

يمكن أن يكون التضمين استثارة الخلايا العصبية من خلال عملية ديناميكية إندو-والرقابة إيونوتروبيك ضادات مستقبلات الغلوتامات. الموصوفة هنا مقايسة موجوداً، وارتفاع محتوى للتحديد الكمي لتجمعات السكان مستقبلات السطحية والداخلية.

مقايسة محتوى عالية لرصد امبا مستقبلات الاتجار

يصف هذا التقرير فحص المنظفات المختلفة لإعداد GPCR البصرية، رودوبسين، ومجمعها مع مصغرة Go. يتم عرض الطرق الكيميائية الحيوية التي تميز نوعية المجمع في مراحل مختلفة أثناء التنقية. يمكن تعميم هذا البروتوكول على مجمعات بروتين غشاء أخرى لدراساتهم الهيكلية في المستقبل.

الفحص الاستراتيجي وتوصيف مجمع إشارات البروتين البصرية GPCR-mini-G للتبلور الناجح

هنا ، يتم وصف الطرق غير الغازية لتوطين بروتينات غشاء المستقبلات الضوئية وتقييم تنكس الشبكية في العين المركبة ذبابة الفاكهة باستخدام تألق eGFP.

دراسة الاتجار بالبروتين الغشائي في خلايا مستقبلات ذبابة الفاكهة باستخدام البروتينات الموسومة ب eGFP

في هذا العمل ، تم وصف مقايسة مضان الكالسيوم عالية الإنتاجية داخل الخلايا لألواح 384 بئرا لفحص مكتبات الجزيئات الصغيرة على مستقبلات البروتين G المقترنة المؤتلفة (GPCRs). يتم التعبير عن الهدف ، مستقبل كينين من قراد حمى الماشية ، Rhipicephalus microplus ، في خلايا CHO-K1. يحدد هذا الفحص الناهضات والخصوم باستخدام نفس الخلايا في مقايسة "الإضافة المزدوجة" الواحدة.

مقايسة مضان الكالسيوم "مزدوجة الإضافة" للفحص عالي الإنتاجية لمستقبلات البروتين G المؤتلف

يصف هذا البروتوكول نموذج تراكم الليبوفوسين في الثقافات الظهارية الصبغية الشبكية البشرية شديدة التمايز والاستقطاب (RPE) ومقايسة البلعمة المحسنة للجزء الخارجي (OS) للكشف عن إجمالي سعة استهلاك / تدهور نظام التشغيل ل RPE. تتغلب هذه الطرق على قيود نماذج ليبوفوسين السابقة ومقايسات البلعمة الكلاسيكية لمطاردة النبض.

تحسين نماذج ليبوفوسين والقياس الكمي لقدرة البلعمة في الجزء الخارجي في الثقافات الظهارية الصبغية للشبكية البشرية شديدة الاستقطاب

هنا ، نصف طريقتين كميتين لدراسة تفاعلات البروتين والترابط لمستقبلات غشاء فيتامين أ ومستقبلات الضوء opsin مع الروابط الفسيولوجية الخاصة بها.

منهجية دراسة تفاعلات مستقبلات غشاء فيتامين أ وبروتين أوبسين مع روابطها في توليد بروتين الريتينيليدين

تعلم تقنية التصوير عالي المحتوى لقياس نقل رودوبسين المرتبط بمرض التنكس الشبكي الصباغي. تُستخدم هذه الطريقة لتحليل توطين البروتين على سطح الخلية وتقييم آثار الأدوية بسرعة.

مقايسة نقل رودوبسين بتحليل التصوير عالية-المحتوى

استكشف المزيد من الفيديوهات