تحقيق تبعيات الجينية باستخدام فحوصات كريسبر-Cas9-تعتمد المنافسة

هذا الفيديو سوف تظهر طريقة بسيطة للتحقيق في الجينات مرشح متعددة في مكافحة غسل الأموال في موازاة ذلك، وذلك باستخدام نظام كريسبر كاس9 جنبا إلى جنب مع تحليل التدفق أساس قياس النمو التنافسي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة وقابلة للتطوير. إثبات الإجراء سيكون بو روي تشن، وثيقة وظيفة من مختبرنا.

يتم استخدام برنامج تصميم CRISPR على الويب لتصميم أربعة إلى ستة RNAs دليل واحد للجين من الفائدة. للبدء، قم بتعبئة المعلومات المناسبة في الحقول باستخدام العلامات النجمية. ثم حدد الجينوم الهدف لتصميم RNA دليل واحد.

الصق التسلسل المستهدف في مربع التسلسل، وانقر على زر الإرسال. الاستنساخ في المطلوب دليل واحد RNA التعبير plasmid، prepend النيوكليوتيدات CACC إلى oglionucleotide الشعور وAAAC إلى بقية اديونوكليوتيد العكسية مجانية. ثم يتم طلب الشعور الممززج والمعادية للحس القلاغن من شركة في لوحة 96 بئر ، وصفت Oligo Mix.

تعيين منفصلة يو القاع 96 لوحة جيدا، وصفت لوحة الهاليينغ. إعداد مزيج رئيسي من ميكرولتر واحد من T4 متعددة النوكليوتيد كيناز، وميكر واحد من 10x T4 العازلة ربط الحمض النووي، وستة ميكرولترات من الماء في رد فعل التليد. إضافة 8 ميكرولترات من المزيج الرئيسي إلى كل بئر من لوحة الهايينغ، تليها 2 ميكرولتردات من الشعور المخلط مسبقًا و oligonucleotides المضادة للحس.

الماصات مرتين إلى ثلاث مرات بلطف لخلط جيدا، ثم تدور لوحة لفترة وجيزة للحصول على يمزج إلى الجزء السفلي من الآبار. استخدم برنامج الـحند التالي في جهاز PCR. 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و95 درجة مئوية لمدة دقيقتين و30 ثانية، يليها تبريد بطيء إلى 22 درجة مئوية بمعدل 0.1 درجة مئوية في الثانية.

عندما يكتمل الضم، أعد لوحة 96 بئرًا جديدة، تسمى مزيج أوليغو المخفف، عن طريق تمييع القلوية الفوسفورية والمصلية من رد الفعل الصلب من واحد إلى 200 مع الماء. خطية أحادية توجيه RNA التعبير عن طريق هضم خمسة ميكروغرام من المتجه مع 1.5 ميكرولترات من BBS1 إنزيم تقييد، وذلك باستخدام المخزن المؤقت المناسب في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. المقبل، واتخاذ لوحة جديدة 96 جيدا المسمى لوحة الربط، وإضافة 20 نانوغرام من BBS1 هضم هضم 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000

إلى هذا، إضافة 2 ميكرولتردات من القلاغوت المشقوق من لوحة Oligo Mix المخففة. أضف إلى كل بئر، ميكرولتر واحد من 10X T4 العازلة، وميكر واحد من انزيم T4 ligase، وماصات بلطف لخلط. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

حوالي 10 دقائق قبل أن يتم التفاعل الربط، ملء 90 ميكرولترات من الخلايا القولونية المختصة كيميائيا على الجليد. نقل 10 ميكرولتر aliquots من الخلايا المختصة في كل بئر من لوحة 96 جيدا منفصلة على حدة. يضاف خليط الربط إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا المختصة.

الماصات صعودا وهبوطا بلطف، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. Pipette خمسة ميكرولترات من مزيج الحمض النووي البكتيريا من كل تفاعل تحويل مباشرة إلى بئر من 6 لوحة بئر، تحتوي على LB أجار مع 100 ملليغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين. إضافة ما يقرب من خمسة إلى ثمانية حبات الزجاج إلى كل بئر، ويهز لوحة 6 جيدا ثماني إلى 10 مرات في حركة دائرية.

احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، واختيار واحد إلى اثنين من المستعمرات الفردية من كل بئر، مع تلميح الماصات ميكرولتر 20 معقم، و streak على بقعة وصفت على طبق بتري عقيمة 10 سنتيمترا، مع LB agar و 100 ملليغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين بعد streaking على لوحة LB، وإخراج تلميح في ثلاثة ملليلتر من المتوسط أمبيرلين في 14 ملليلتر أسفل الأنبوبة ، تم وضع علامة على رقم استنساخ البكتيريا المطابق. ثم يتم إرسال لوحة بكتيرية مباشرة لتسلسل سانجر.

بعد تأكيد تسلسلي لـ RNAs المستنسخة، طهر الحمض النووي من أنبوب 14 ملليلتر المقابل، باستخدام مجموعة صغيرة الإعدادية وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. يتم إنتاج جزيئات RNA النادسية أحادية الدليل في شكل 96 بئرًا ، كما هو موضح في بروتوكول النص. ويتم تجميد المابير الفيروسية على الفور في ناقص 80 درجة مئوية.

قبل يوم واحد من تحويل RNAs دليل واحد في الخلايا AML Cas9، معطف مسطحة أسفل غير الأنسجة الثقافة تعامل 96 لوحة جيدا، مع 100 ملليلتر من الليفية البشرية المؤتلف جزء في تركيز 10 ميكروغرام لكل ملليلتر. التفاف لوحة مع التفاف التشبث لتجنب فقدان التبخر، وتركها على مقاعد البدلاء بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إزالة جزء الليفية البشرية المؤتلف من كل بئر من لوحة 96 جيدا.

ذوبان في الفيروسية افرا من كل دليل واحد RNA في درجة حرارة الغرفة. إضافة 50 ميكرولترات من الفيروسية متجاوز من كل أنبوب إلى كل بئر المغلفة من لوحة النقل. التفاف لوحة مع التفاف التشبث لتجنب التلوث المحتمل أثناء الطرد المركزي.

تدور لوحة في 1, 300 مرات ز في 35 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. قرب نهاية من ال [سبينفأيشن], عدّ ال [هس 9] عال يعبر يستنسخ [ب3] خلايا من الثقافة قارورة. بعد العد، تدور أسفل العدد المطلوب من الخلايا، و resuspend في وسط جديد.

بعد 90 دقيقة spinfection، استخدام ماصة متعددة القنوات تعديلها إلى 50 ميكرولترات لإزالة عظمى من جميع الآبار ببطء عن طريق إمالة لوحة. إضافة 100 ميكرولتر من ثقافة استنساخ الخلايا B3 إلى كل ببطء، والانزلاق إلى أسفل من الحافة. تدور لوحة في 1، 300 مرات ز في 35 درجة مئوية لمدة دقيقتين للسماح للخلايا تستقر إلى أسفل.

نقل لوحة إلى 37 درجة مئوية زراعة الأنسجة حاضنة الصف. في اليوم التالي، إضافة 100 ميكرولترات من المتوسطة الطازجة إلى كل بئر تحتوي على دليل واحد RNA الخلايا المستحثة، بحيث يكون حجم المتوسط النهائي 200 ميكرولترات. أعيدوا الصحن إلى الحاضنة.

72 ساعة بعد نقل، والتحقق من النسبة المئوية من الجيش الملكي النيبالي دليل واحد يحتوي على الخلايا الإيجابية BFP في كل بئر عن طريق تدفق عملية استئصال الخلايا. استخدام صبغة جدوى الخلية لوضع علامة على الخلايا الميتة واستبعادها من التحليل. مواصلة إعادة طلاء نسبة من الخلايا في آبار جديدة مع المتوسطة الطازجة بعد كل تحليل الحقائق لتجنب فرط النمو أثناء الفحص.

كل يومين إلى ثلاثة أيام، كرر تحليل الحقائق للتحقق من النسبة النسبية للخلايا الإيجابية BFP مقارنة مع نظرائهم السلبيين BFP. تحليل النسبة المئوية للخلايا الإيجابية BFP لكل نقطة زمنية، وذلك باستخدام برنامج تحليل الحقائق. مفتاح نجاح تحليل الانتشار التنافسي هو استخدام تقنيات البوابات المناسبة لضمان دقة أرقام الخلايا الحية في نهاية المطاف.

اسحب FCS الملفات لكل عينة في البرنامج. انقر نقراً مزدوجاً فوق أي ملف عينة واحد، و قم برسم رسم نقطة من مبعثر إلى الأمام مقابل تشتت الجانب، مع مبعثر إلى الأمام على المحور س، وتشتت جانبي على المحور ص. بوابة جميع الخلايا.

انقر نقرا مزدوجا فوق الخلايا المسور، ومؤامرة وصمة عار على محور y مقابل ارتفاع مبعثر إلى الأمام أو منطقة نقطة مؤامرة. بوابة الخلايا السلبية البقعة البقاء. انقر نقراً مزدوجاً فوق الخلايا المباشرة المسورة، وارسم BFP على محور ص مقابل التشتت الأمامي على المحور س.

بوابة الخلايا الإيجابية BFP. تطبيق كافة هذه البوابات على كافة العينات عن طريق سحب العينة المحددة إلى كافة العينات تحت علامة التبويب المجموعة. انقر على محرر الجدول لجعل جدول تحليل جميع العينات.

اسحب عدد موجب BFP من عينة واحدة إلى الجدول، وانقر فوق زر العرض في محرر الجدول لإنشاء تقرير دفعي لكافة العينات، مع عرض الجدول النسبة المئوية للخلايا الإيجابية BFP. حفظ الجدول كملف Excel. وقد استخدم هذا النظام لدراسة دور الجينات التي قد تلعب دوراً في انتشار أو بقاء خطوط خلايا مكافحة غسل الأموال البشرية والمورين.

استهداف AAVS1 مكان آمن الميناء مع اثنين من منفصلة دليل واحد RNAs لم يكن له أي تأثير على انتشار الخلايا البشرية MOM13 Cas9 في المقابل ، عندما تم استهداف الحمض النووي النسخ المتماثل المرتبطة الجينات ، RPA3 ، لوحظ انخفاض تدريجي وكبير في النسبة المئوية للخلايا الإيجابية BFP مقارنة مع النظراء غير المُنقلين السلبيين BFP. وبالمثل، تم اختبار آثار RNAs دليل واحد تستهدف Dot1l، وهو منظم اللاجينية، وRodopsin، جين تصبغ العين، في خلايا MLL-AF9 Cas9 الماوس. دليل واحد RNAs استهداف Dot1l، وأظهرت انخفاضا كبيرا وتدريجيا في الانتشار التنافسي على النقيض من RNAs دليل واحد يستهدف رودpsin.

هذه النتائج تبين ضعف MLL-AF9 التعبير عن خلايا سرطان الدم الجماعي لاستنفاد Dot1l, تأكيد النتائج التي نشرت سابقا. على افتراض أربعة إلى ستة RNAs دليل لكل جين، وهذا الأسلوب هو مناسبة تماما لاستخدامها لاختبار ما لا يقل عن 16 إلى 24 الجينات بالتوازي، ويمكن أيضا أن تطبق لاختبار التبعيات الجينات في أي خط الخلايا السرطانية. في حالة وجود عدد أكبر من الجينات، مثل المسار الجزيئي بأكمله الذي يحتاج إلى اختبار في خلايا مكافحة غسل الأموال، سوف تجمع CRISPR-Cas9 الشاشات القائمة تكون أكثر فائدة.