متعدد الفلورسنت المناعي تلطيخ والتصوير والتحليل في عينات نسيجية من سرطان الغدد الليمفاوية
January 9th, 2019
هنا يمكننا وصف بروتوكول متعدد المناعي الفلورسنت تلطيخ والتصوير للترجمة المتزامنة متعددة المستضدات المرتبطة بالسرطان في الأورام اللمفاوية. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتحليل المؤشرات الحيوية داخل جميع أقسام الأنسجة كولوكاليزيشن.
الأورام اللمفاوية هي أورام معقدة من الناحية النسيجية. لذلك ، يوفر الكيمياء المناعية الفلورية متعددة الفلورسنت مزايا أكثر من الكيمياء المناعية التقليدية الملونة لدراسة علامات الاهتمام في الخلايا السرطانية و البيئة الدقيقة. هذه التقنية لديها القدرة على توحيد التهديف من الأجسام المضادة القائمة على تلطيخ في عينات الغدد الليمفاوية النسيجية، وهي العملية التي كانت تاريخيا تحديا بسبب تعقيد البيئة الدقيقة الورم.
على وجه التحديد، متعدد الفلوريسسينت المناعية والتصوير الطيفي يسمح القياس الكمي من بقع متعددة داخل شريحة واحدة، مما يسمح بتقييم التعبير المشترك المستضد والعلاقة الزبيسية داخل المواد السريرية. تبدأ من خلال غمر الشرائح دي مشمع وإعادة تهيئي في مخزن استرداد المستضد القياسية في جرة الزجاج حفظ الميكروويف وأداء الحرارة الناجمة عن استرجاع epitope في الميكروويف مناسبة. تنفيذ جولات إضافية من تجريد الميكروويف على أساس موقف الجسم المضاد في تسلسل متعدد النهائي.
على سبيل المثال، يتطلب الجسم المضاد الرابع ثلاث جولات إضافية من تجريد الميكروويف قبل تلطيخ. بعد الانتهاء من عملية تجريد، واستخدام ملقط وقفازات واقية من الحرارة لنقل الشرائح إلى الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة على الأقل تهدئة. عندما يبرد محلول استرجاع المستضد ، قم بحظر نشاط بيروكسيديز الأنسجة مع كتلة بيروكسيديز التجارية لمدة 10 دقائق تليها غسل لمدة خمس دقائق في محلول ملحي مخزن بالتراين ، أو TBS ، ومنظفات غير أيونية.
كتلة أي تلطيخ غير محدد مع حضانة 10 دقيقة في منع العازلة تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وثلاثة خمس دقائق يغسل مع TBS-D العازلة. بعد ذلك ، احتضان العينات مع جسم مضاد ثانوي مناسب من الفجل peroxidase لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها ثلاثة يغسل في عازلة TBS-D كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير، وتطبيق المشعاع التيراميد المناسبة القائمة على الشرائح لحضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة خمس دقائق TBS-D يغسل.
تنفيذ عملية تجريد إضافية على الموجات الدقيقة لإزالة الأجسام المضادة الأولية والثانوية في محلول استرجاع مستضد جديد كما هو موضح. في نهاية الاسترجاع، يبرد الشرائح في الماء المقطر ويجفف المناطق على الشرائح بدون أنسجة مع مناديل معملية. احتضان الشريحة مع dappy لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة يغسل TBS-D.
ثم، قم بتجفيف الشرائح بعناية باستخدام مناديل المختبر دون الاتصال بالأنسجة وقم بتركيب العينات مع وسيلة مناسبة للتصوير. بالنسبة لمسح الشريحة أحادية الضفير، حدد الفلاتر المناسبة من الفلوروفهورات المستخدمة في وضع العلامات على العينات وفحص كل علامة وقناة الفلورسينس المقابلة لتحديد وقت التعرض المناسب للحصول على إشارة نظيفة، مع التركيز على مكون الأنسجة الذي يجب أن يكون له أقوى إشارة للعلامة. للسماح بالمقارنة بين العينات بين كثافة البكسل، استخدم إعداد الكاميرا المباشرة لضبط وقت التعرض في كل قناة على حدة حتى لا تكون هناك مناطق مكشوفة في صورة الكاميرا المباشرة.
عندما يتم مسح جميع الشرائح، الحصول على صور حقل مشرق محاكاة لمقارنتها بصريا مع نمط المناعة الطبيعية وتحديد ما إذا كان نمط تلطيخ هو الصحيح. لمسح شرائح ميكروراي الأنسجة، استخدم وضع المسح الضوئي للميكروراي في نظام التصوير و خوارزمية التركيز التلقائي المناسبة. بالنسبة للشرائح المقطعية للأنسجة الكاملة، قم بمراجعة الشرائح من قبل أخصائي أمراض مؤهل لتحديد الصور المثلى من مناطق الأورام الأكثر تمثيلاً.
قبل البدء في التحليل، حدد علامة ورم لتحديد الخلايا التي تهم التحليل. واطلب أخصائي علم الأمراض مراجعة الصور وقرر ما إذا كان هناك حاجة إلى تجزئة الأنسجة. إذا لزم الأمر، حدد مناطق التحكم المناسبة للتجزئة وتحقق مما إذا كان برنامج تحليل الصور يمكنه التعرف على هذه المناطق بشكل صحيح.
بعد تجزئة الخلية، يكون أخصائي علم الأمراض مراجعة خريطة تجزئة لضمان دقة نهج التجزئة المقصود ومراجعة الصور الفردية لتحديد ما إذا كان تقسيم الخلية كافية أو إذا كان هناك حاجة إلى تقسيم الأنسجة إضافية لتحديد المناطق المخصب للخلايا السرطانية، stroma، أو نخر. ثم تحديد قيمة قطع كثافة الضوئية إيجابية لكل علامة بالاقتران مع الطبيب الشرعي وتوليد المدرج التكراري في برنامج الإحصاء المناسب لتحليل توزيع التردد من كثافة علامة لكل خلية. لإنشاء بيانات النسبة المئوية لعلامات معينة ذات أهمية داخل الخلايا المحددة، قم بإدراج جدول محوري في ورقة البيانات وحدد Sum لحساب النسبة المئوية للإيجابية لعلامة فائدة واحدة.
سيتم حساب العدد الإجمالي للخلايا الموجبة للعلامة مقسومًا على العدد الإجمالي. والنتيجة هي النسبة المئوية للنسبة المئوية للنسبة الإيجابية للخلية مع نواة واحدة، أو رقم دراسة واحد. لتوليد بيانات رقمية، الحصول على متوسط كثافة كل علامة الاهتمام في جميع الخلايا دراسة داخل عينة لاستخراج متوسط عدد تطبيع لكل علامة من كل رقم الأساسية أو الدراسة.
هنا، يتم عرض صور متعددة الفلورسنت مناعية متعددة الفلوريولوجية لعينة سرطان الغدد الليمفاوية B-الخلية الكبيرة المنتشرة مع c-MYC و BCL2 الجينات إعادة ترتيب. محاكاة مشرق مجال المناعة المناعة الصور تدل على نمط وصمة مماثلة علامة الورم. تطبيق الصور متعددة الفلورسنت المناعية الفلورية على لوحة الخلايا التائية في الأورام اللمفاوية الخلايا التائية angioimmunoblastic يكشف عن عدم تجانس الخلية من عينة الورم.
هنا، يتم عرض الأمثل لعينة التحكم اللوزتين وتحليل البيانات الناتجة. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من برامج تحليل الصور بعد الخطوة غير المحيرة إلى التعبير الكمي لعلامة وتوطين في الخلايا السرطانية والورم microenvironment. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لدراسة التعبير المشترك من علامات متعددة داخل أنواع خلايا محددة في أقسام الأنسجة المفردة من سرطان الغدد الليمفاوية.
الحرص على منع الإصابة الناجمة عن الحرارة أثناء خطوات microwaving وتكون على بينة من مخاطر السقوط أثناء خطوات المسح الضوئي التي يتم تنفيذها في سطح السفينة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً للتلوين المناعي المناعي المتعدد القنوات والتصوير لتحديد مكان العديد من المستضدات المرتبطة بالسرطان في اللمفوما. تسمح الطريقة لتحليل التوطين المشترك للمؤشرات الحيوية داخل أقسام الأنسجة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- الكيمياء المناعية
- بيولوجيا السرطان
الخلفية
- اللمفوما هي أورام معقدة من الناحية النسيجية.
- توفر الكيمياء المناعية المتعددة القنوات المزايا على الأساليب التقليدية.
- تساعد هذه التقنية في دراسة علامات الورم والبيئة المكروية.
- كان التوحيد في تسجيل التلوين المستند إلى الأجسام المضادة تحديًا تاريخيًا.
هدف الدراسة
- لتطوير بروتوكول لتحديد مكان العديد من المستضدات المرتبطة بالسرطان في وقت واحد.
- تسهيل تقييم التوافر المشترك للمستضدات.
- تحسين فهم العلاقات المكانية داخل المواد السريرية.
الطرق المستخدمة
- نقع الشرائح المنزوعة الشمع وإعادة ترطيبها في محلول استرجاع المستضد.
- استرجاع الأشكال الظهارية المحدث بالحرارة باستخدام الميكروويف.
- تقشير إضافي بالميكروويف بناءً على تحديد موقع الجسم المضاد.
- قياس كمي لمتعدد التلوينات داخل شريحة واحدة.
النتائج الرئيسية
- تحديد ناجح لعدة مستضدات مرتبطة بالسرطان.
- قدرة محسنة على تقييم التوافر المشترك للمستضدات.
- تحسين التوحيد في تسجيل العينات النسيجية.
- تسهيل تحليل البيئة المكروية للورم.
الاستنتاجات
- الكيمياء المناعية المتعددة القنوات هي أداة قيّمة لأبحاث اللمفوما.
- يمكن تكييف البروتوكول لمختلف أقسام الأنسجة.
- قد تؤدي هذه الطريقة إلى فهم أفضل لبيولوجيا السرطان.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Multiplexed fluorescent immunohistochemistry enables quantitative assessment of multiple protein targets within complex lymphoma tissue sections, addressing a key challenge in biomarker validation. By preserving spatial context and minimizing sample consumption, the method supports mechanistic de-risking in early discovery and improves predictive confidence for target prioritization. This capability enhances translational continuity from discovery through preclinical evaluation in oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through co-expression analysis of lymphoma subtype markers in specific cell types.
- Operational Value: Reduces sample utilization by allowing multiplexed readouts from single tissue sections, increasing throughput in target validation workflows.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by clarifying antigen spatial relationships within the tumor microenvironment, informing functional target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative outputs including mean intensity and percentage positivity per marker, enabling standardized scoring across histological samples.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through optimized antibody stripping and staining cycles, improving reproducibility in biomarker assays.
- Platform Reuse: Compatible with tissue microarray (TMA) scanning and whole tissue section analysis, supporting scalable screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains spatial and quantitative fidelity from discovery samples through preclinical validation, supporting biomarker alignment.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions by quantifying marker expression in defined cellular compartments of lymphoma models.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in pathway interpretation by resolving antigen co-expression patterns in complex tumor stroma.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supporting hypothesis testing in early biology, enabling assay-ready biomarker panels for screening, and providing quantitative analytics for translational decision-making.
- Discovery Biology: Supports target validation through multiplexed detection of lymphoma markers in tumor and microenvironment compartments.
- Screening: Enables reproducible, quantitative biomarker assessment via standardized staining and imaging protocols suitable for high-content analysis.
- Analytics: Delivers normalized intensity and positivity percentage readouts that facilitate comparative analysis across conditions and samples.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by preserving spatial context and enabling correlation with phenotypic outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunostaining and imaging capability applicable across lymphoma subtypes and therapeutic target panels.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity through spatial multiplexing.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of IHC scoring, reducing inter-operator variability in biomarker assessment.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling parallel biomarker evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets through quantitative, spatially resolved expression data in lymphoma models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, spectral imaging, and image analysis for multiplex fluorescent workflows.
- Dependent on microwave-based antigen retrieval and stripping infrastructure, with optimization needed per antibody sequence.
- Necessitates cross-team standardization between pathology, imaging, and data analysis for consistent segmentation and threshold setting.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to new tissue types or antibody panels beyond lymphoma models.
- Includes practical limitations such as potential signal degradation during iterative stripping and the need for careful thermal control to prevent tissue damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:57
Monoplex Tyramide-Based Immunofluorescence
3:22
Monoplex Slide and Tissue Microarray (TMA) Scanning
4:36
Data Analysis
6:28
Results: Representative Mutiplexed Fluorescent Immunohistochemical (mf-IHC) Staining, Imaging, and Analysis
7:10
Conclusion
