إيمونوبلوتينج كمية من خطوط الخلايا كمعيار للتحقق من صحة الفلورة للتحديد الكمي للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات الأنسجة الروتينية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض السرطان ، من خلال قياس بروتينات المؤشرات الحيوية من مواد الخزعة المعالجة بشكل روتيني. المزايا الرئيسية لهذه التقنية فيما يتعلق بالكيمياء المناعية التقليدية، هي أنها موضوعية، ولها مجموعة ديناميكية واسعة، وتسمح لتحديد كمي للبروتينات في أنواع محددة من الخلايا. وجود أو غياب بعض ما يسمى بروتينات العلامات الحيوية، أو على وجه الخصوص، وفرة نسبية من تلك البروتينات في عينات خزعة السرطان يمكن أن تكون مفيدة جدا في إجراء تشخيص مرضي محدد لأنواع محددة من السرطانات.

ولكن يمكن أن تكون مفيدة أيضا في التنبؤ بالاستجابة لعلاج السرطان، لذلك هذا هو السبب في أن هذه التقنية هي ذات الصلة على حد سواء لتشخيص وعلاج المرضى الذين يعانون من السرطان. هذا البروتوكول هو أساسا حول كيفية استخدام كم البروتين في خطوط الخلايا الخالدة للتحقق من الطبيعة الكمية للمناعة القائمة على الفحص. ولكن من المهم ملاحظة أن الفلورورات المناعية يمكن دمجها بسهولة في نهج متعدد الحساسية، وتطبيقها على عينات الخزعة الأولية.

وسيساعد في هذا الإجراء ويبرهن على ذلك لي بودرو، وهو فني، و شكيل فيرك، مدير العمليات. كلاهما من مختبر الملكة لعلم الأمراض الجزيئية للبدء، الطرد المركزي الخلايا التي تم حصادها سابقا في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر في 225 Gs لمدة خمس دقائق.

Decant الماثرة ، وإعادة فرض بيليه الخلية في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم، الطرد المركزي الخلايا التي أعيد تعليقها في 225 Gs لمدة خمس دقائق. تعليق بيليه الخلية مع 10 ملليلتر من 10٪ NBF.

ثم احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة على الروك في 24 RPMs بين عشية وضحاها. بعد إصلاح الخلايا، الطرد المركزي الخلايا في 225 Gs لمدة خمس دقائق. ثم إزالة فائقة وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.

نقل الخلايا إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر، و بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم، pirate المابير. إضافة ما يقرب من 500 ميكرولترات من 1٪ agarose حل لكل أنبوب تحتوي على الخلايا.

ثم، ماصة الخليط صعودا وهبوطا لخلط. بعد أن يصلب حل الخلايا agarose، إضافة ملليلتر واحد من 10٪ NBF إلى الأنابيب. لاحقاً، إزالة NBF من العينات.

استخدم شفرة حلاقة لإزالة قابس الخلية، ووضع المكونات في كاسيت من الأنسجة البلاستيكية. عينات معالجة بين عشية وضحاها مع معالج الأنسجة الآلي. ثم، تضمين العينات في الشمع البارافين، وذلك باستخدام أساليب علم الأنسجة القياسية.

باستخدام أداة مصفّدة الأنسجة، حصاد 6 مليمترات مكررة من كتلة البارافين، وإدراجها في كتلة البارافين فارغة. بعد ذلك، استخدم ميكروتوم لإعداد قسمين النسيجي من خط الخلية المنشأة حديثا، TMA. ثم قم بتحميل المقاطع على شريحة الأنسجة، وفك زحزحها.

أولاً، قم بتحميل منزلتي خط الخلية TMA في نظام تلوين آلي. وصمة واحدة جانب مع التخفيف الأمثل للجسم المضاد الأولية، وترك الآخر كشريحة تحكم سلبية. على كلا الشرائح، قم بتطبيق علامة مضادة نووية، والأجسام المضادة الثانوية.

بعد عملية تلطيخ، إضافة الكواشف التضخيم إشارة tyramide. بعد ذلك، قم بمسح الشرائح المثبطة للمناعة باستخدام الإثارة المناسبة والأطوال الموجية للكشف عن الفلوروبهورات التي تم استخدامها. استخدام برنامج تحليل الصور لتحديد المقصورة الخلوية من الفائدة، سواء النواة أو السيتوبلازم، وقياس شدة الفلورس متوسط، أو MFI، لكل خط.

لتحديد أي خط الخلية لديه أكبر وفرة من البروتين الهدف، aliquot إعدادها الثمينة خلية lysate في أنابيب microcentrifuge. ثم إضافة 2.5 ميكرولترات من 6x laemly العازلة، ويكفي RIPA تحلل العازلة لتحقيق حجم الكلية إلى 15 ميكرولترات. بعد ذلك، قم بتحميل هلام صفحة SDS، مع سلم البروتين، والعينات المعدة مسبقا.

بعد ذلك، تحميل عازلة laemly في الآبار الفارغة. تشغيل هلام حتى تصل الصبغة الزرقاء إلى الجزء السفلي من لوحة. بعد إجراء نقل البروتين شبه الجاف، استخدم شفرة حلاقة لقطع الغشاء أفقيًا لفصل البروتين الذي يهمك عن بروتين التحكم.

تنفيذ الاحتضان الحجب والأجسام المضادة وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. ثم ضع شرائط الغشاء في كيس بلاستيكي واضح. استخدام ماصة P1000 لتغطية الأغشية مع خليط ECL.

ثم ختم الكيس، واحتضان الأغشية في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة دقيقة إلى دقيقتين. بعد ذلك، ضع الكيس البلاستيكي الذي يحتوي على الأغشية في منصة تصوير رقمية. استخدام chemiluminescence وكشف علامة colorimetric لالتقاط مختلف التعرض للغشاء.

باستخدام برنامج تحليل الصور، أو الملاحظة البصرية، تحديد خط الخلية يعبر عن البروتين الأكثر استهدافا. بعد مناعة تخفيف تسلسلي من هذا الخط الخلية، وفتح صور التعرض باستخدام برنامج تحليل الصور. استخدم أداة التحديدات المستطيلة لتحديد المسار الأول من الجل.

ثم انتقل إلى تحليل، المواد الهلامية، وحدد المسار الأول. كرر هذه العملية عن طريق نقل أداة التحديدات المستطيلة إلى الممر التالي ، وانتقل إلى التحليل ، والمواد الهلامية ، وحدد المسار التالي. بعد ذلك ، انتقل إلى تحليل ، والمواد الهلامية ، والممرات مؤامرة.

استخدام أداة خط مستقيم لرسم خطوط عبر أسس كل قمة ، لإزالة الضوضاء الخلفية. ثم استخدم أداة العصا لتحديد كل قمة، والحصول على شدة النطاق لكل ذروة من نافذة النتائج. إنشاء مبعثر من كثافة الفرقة مقابل كمية من البروتين الكلي محملة لكل الأجسام المضادة الأولية باستخدام الناتج قياس الكثافة.

ثم استخدم خطًا من أفضل الملاءمة والملاحظة البصرية لتحديد موقع النطاق الديناميكي الخطي لكل جسم مضاد. حدد تركيز البروتين الذي ينتج كثافة الفرقة داخل النطاق الخطي، وأداء مناعي من جميع lysates خط الخلية مع أن تركيز البروتين، كما هو موضح سابقا. بعد ذلك، قم بإجراء قياس الكثافة على الفحوصات الرقمية، واختيار عمليات التعرض التي تنتج إشارات داخل النطاقات الخطية التي تم تحديدها مسبقًا لكل جسم مضاد.

بعد ذلك، حساب نسبة كثافة الفرقة البروتينية المستهدفة إلى كثافة نطاق التحكم في التحميل لكل خط خلية. وأخيراً، استخدم البرامج الإحصائية لإجراء اختبار ارتباط Pearson بين القيم التي تم الحصول عليها من تحليل الصورة لتلطيخ IF، وتلك التي تم الحصول عليها من التلطخ المناعي. وقد استخدم هذا البروتوكول لتأكيد قدرة IF لتحديد الكمية النسبية للبروتين المضاد للبروتين المضاد للبروتين Bcl-2.

تم اختبار تم تخفيف متفاوتة من الأجسام المضادة الأولية على أنسجة اللوزتين البشرية مع stainer المناعة. لهذه التجربة، تم تحديد تخفيف واحد إلى 50 ليكون التخفيف الأمثل الذي أسفر عن إشارة قوية مع القليل من الضوضاء الخلفية. وقد استخدم هذا التخفيف لطخة TMA خط الخلية عن طريق المناعةfluorescence، واستخدمت تحليل الصور لتحديد كمية إشارة Cy5 السيتوبلازمي المنسوبة إلى Bcl-2.

استنادا إلى منطّط لجميع خطوط الخلايا المختبرة، كان غرانتا-519 أكبر وفرة من Bcl-2. ثم تم استخدام مناعي من التخفيف المسلسل من غرانتا-519 lysate للعثور على مجموعة ديناميكية خطية من Bcl-2، والسيطرة على البروتين GAPDH. تراوحت المدى الديناميكي لـ Bcl-2 في هذا الفحص من كثافة النطاقات من 0 تقريبًا ، إلى 7500 وحدة.

تراوحت مجموعة ديناميكية لـ GAPDH من 3000 إلى 6500 وحدة. وتكرر الناعَز مع التعرض داخل ذلك النطاق الخطي. وتم حساب نسبة Bcl-2 إلى GAPDH لكل خط خلية.

أظهر اختبار ارتباط Pearson أن نسب الكثافة من مناعة المناعة كانت مرتبطة بقوة وإيجابية بقراءات الكثافة من IF الكمي. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تكشف عن الغشاء النهائي لنقاط زمنية متعددة، من أجل العثور على التعرض الأمثل حيث جميع العصابات هي ضمن النطاقات الخطية الخاصة بها. بعد التحقق من الطبيعة الكمية لبروتوكول IF ، يمكن تعديله لـ multix IF ، في عينات الأنسجة المعالجة بشكل روتيني من أجل الإجابة على الأسئلة السريرية مثل حيث يتم التعبير عن البروتين المستهدف.