نقل نحققها جبرلين الخلوية مستويات استخدام الطاقة الرنين فورستر NlsGPS1 بيوسينسور (بكى)

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تطوير النبات فيما يتعلق بتوزيع phytohormones النمو. باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية FRET المشفرة وراثيا، على سبيل المثال nlsGPS1 الذي يكشف الثرثرة، فمن الممكن لقياس التوزيع الديناميكي للمركبات الهامة في الأنسجة Arabidopsis في الحل الخلوي. عموما ، فإن الأفراد الجدد لهذه المسألة النضال ، وذلك لأن تحليل FRET biosensors ينطوي على التصوير نسبة التي زادت من الضوضاء والخطوات التحليلية الإضافية مقارنة مع التصوير القياسى النية.

تبدأ بذر ما يقرب من 20 بذور arabidopsis تعقيم على 1/2 Murashige و Skoog أو MS agar لوحات مربعة. ختم لوحات مع الشريط الجراحي المسام والتفاف عليها مع رقائق الألومنيوم لمدة يوم واحد إلى ثلاثة أيام من الحضانة في أربع درجات مئوية للتقسيم الطبقي. بالنسبة للتصوير الجذري، قم بنقل اللوحات إلى غرفة نمو في اتجاه عمودي لمدة ثلاثة أيام في ظل الظروف المشار إليها.

بالنسبة لهيبكوتيل الغامق، قم بنقل اللوحات إلى غرفة النمو لنبض ضوئي لمدة ساعة إلى أربع ساعات لمزامنة الإنبات. ثم التفاف لوحات مع رقائق الألومنيوم، ووضعها في غرفة النمو في اتجاه عمودي لمدة ثلاثة أيام. لقياسات ثابتة للدولة، إضافة 50 ميكرولترات من محلول وهمية لشريحة المجهر نظيفة ووضع بلطف ثلاثة نووي موضعية استشعار الإدراك الثرثرة واحد أو nlsGPS1 التعبير عن الشتلات على الشريحة.

ثم بقعة قطرة الشحوم فراغ على كل زاوية من زلة غطاء نظيفة ومكان بلطف لتغطية زلة على الشتلات. إضافة بعناية حل وهمية اضافية لإزالة أي فقاعات الهواء حسب الضرورة. قبل معالجة الثرثرة أربعة أو GA4 ، استخدم حقنة 20 ملليلتر مليئة الشحوم الفراغية ومجهزة بطرف ماصات 200 ميكرولتر معدل مع فتحة قطرها ملليمتر واحد لرسم ثلاثة سنتيمترات طولها ثلاثة سنتيمترات ونصف طولها مستطيل عرض سنتيمتر واحد ونصف على شريحة زجاجية نظيفة.

إضافة 50 ميكرولتررس من حل وهمية إلى وسط المستطيل واستخدام ملقط نظيفة لرفع nlsGPS1 التعبير عن الشتلات من الجانب السفلي من كوتيليدونس لنقل دقيق في الحل وهمية. ضع زلة غطاء رصدت مع الشحوم فراغ كما أظهرت للتو في وسط مستطيل الشحوم فراغ وملء بعناية الخزان مع حل وهمية اضافية دون إزعاج الشتلات. ثم الحصول على صور من الشتلات على مجهر confocal مجهزة الليزر المناسبة لCFP مثيرة وYFP لتنفيذ التصوير نقل الطاقة الرنين فورستر.

لGA4 للعلاج، وإزالة الشريحة من مرحلة المجهر وتعيين جهاز توقيت لمدة 20 دقيقة. إزالة على الفور حل وهمية من الجانب الأيمن من زلة الغطاء في حين إضافة 17 ميكرولترات من السائل واحد MS ربع تكمل مع GA4 المول الصغير واحد إلى الجانب الأيسر من زلة الغطاء حتى تم استبدال كل من حل وهمية. ثم ضع الشريحة الزجاجية مرة أخرى على مرحلة المجهر وانتظر 10 دقائق أخرى قبل الحصول على صورة العلاج GA4 بعد.

لإعداد دورة زمنية لنسيج من الاهتمام، إضافة 200 ميكرولترات من محلول وهمية إلى مركز قناة القذف من شريحة لزجة ibidi، ووضع بلطف شتلات nlsGPS1 في الحل وهمية كما هو موضح. استخدام ملقط لوضع بلطف زلة الغطاء على الشتلات باستخدام المؤخر من ملقط للضغط بلطف على الحواف الخارجية للغطاء زلة حتى يشكل رابطة قوية مع المواد لزجة على هامش الشريحة لزجة. بعد ذلك، استخدم اثنين من 0.8 ملليمتر الداخلية قطر المرفق لور الموصلات و 0.8 ملليمتر قطعة القطر الداخلي من أنابيب السيليكون لربط الشريحة لزجة إلى حقنة 20 ملليمتر مليئة حل وهمية وربط الشريحة إلى حاوية منفذ لجمع حل تدفق.

اغسل الغطاس بلطف للاستغناء عن حل كاف للغرفة لضمان عدم وجود فقاعات الهواء ومن ثم تحميل الحقنة على مضخة حقنة قابلة للبرمجة. ثم بدء تشغيل المضخة لبدء دورة الوقت. لعلاجات GA4 خلال الدورة الزمنية ، أوقف المضخة مؤقتًا لإيقاف التسريب واستبدل المخزن المؤقت الوهمي الذي يحتوي على حقنة مع حقنة مليئة بربع سائل MS مكمّل بـ GA4.

لتحليل الصور ثلاثية الأبعاد، قم باستيراد الملفات إلى برنامج تحليل الصور IMARIS وفتح معالج الأسطح. تعيين الطرح الخلفية إلى ثلاثة ميكرون وعتبة إلى الافتراضي. أثناء تجزئة النوى الحرص على عدم إدراج العديد من النوى مع الفلوري خافت كما أن نسبة حصة إشارة إلى ضجيج من الجسم مع مستويات خلفية قريبة من إشارة ستكون منخفضة جدا لتحليل الصورة نسبة.

ثم قناع قنوات الانبعاثات CFP وFRET على أساس الأسطح التي تم إنشاؤها باستخدام انبعاثات YFP. استخدام متوسط نسبة كثافة XT التمديد لحساب نسبة من الانبعاثات المانحة الإثارة قبول مقسوما على المانح الإثارة الانبعاثات المانح بين متوسط قيم كثافة السطوح الفردية في القنتين. لتلوين الأسطح الفردية مع نسبة الانبعاثات nlsGPS1، حدد ترميز اللون مع الإحصاءات وتعيين متوسط نسبة كثافة كنوع الإحصاءات.

ضمن رمز الإحصاءات، قم بتصدير نسب القيم الفردية من الجدول ونسخ القيم ولصقها في جدول بيانات للتمثيل الرسومي للبيانات. في جذر Arabidopsis ، معامل الانحدار نسبة الانبعاثات nlsGPS1 يدل على انخفاض مستويات GA4 في مناطق meristematic ومناطق التقسيم ومستويات الجمعية العامة العالية في منطقة استطالة في وقت متأخر. وعلى النقيض من ذلك، لا يُلاحَظ تدرج نسبة الانبعاثات في الجذور غير القائمة على التسوية nlsGPS1، مما يوحي بأن تدرج GA4 الداخلي ليس من الآثار الملموسة.

كما يتم تشكيل تدرج نسبة الانبعاثات nlsGPS1 في hypocotyls داكنة النمو مع مستويات منخفضة في كوتيليدونس والخطاف النموذجي والمستويات العالية في المنطقة القاعدية الممدودة بسرعة من hypocotyl. وعلى النقيض من ذلك، لا يُلاحَظ تدرج نسبة الانبعاثات في الهايبوكولات غير المُخصصة للنسبة الوطنية. وعلاوة على ذلك، تتراكم GA4 الموردة بشكل خارجي بشكل تفضيلي في منطقة استطالة بالمقارنة مع منطقة تقسيم جذر Arabidopsis مما يشير إلى أنه يمكن استخدام nlsGPS1 لدراسة أنماط الجمعية العامة الذاتية والخارجية.

بالإضافة إلى ذلك ، تحليل الدورة الزمنية لبذلات NLSGPS1 المعالجة GA4 ، يكشف عن تراكم أسرع من GA4 خارجية في اطالة الجذر حتى بالمقارنة مع منطقة التقسيم. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر لتجنب البكسل المشبعة أثناء التصوير الكمي للحفاظ على المعلمات التصوير ثابتة ولتقليل مشاكل الانجراف وتغيير التنسيق أثناء التسريب العينة. بعد هذا الإجراء وضعت الأساليب، مثل جذور التصوير المتنامية في أجهزة التحكم في نوع رقاقة الجذر يمكن تنفيذها للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية تغيير تدرجات GA في نصائح جذر Arabidopsis تنمو بمعدلات مختلفة أو استجابة للإجهاد بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للبحث في مجال نمو النباتات لاستكشاف التوزيع الديناميكي لالثرثرة في الأنسجة الأعضاء الإضافية Arabidopsis thaliana.