تحليل القص الناجمة عن تدفق الهجرة من المنطقة الهامشية الفاري ب الخلايا في المختبر

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم الأسئلة الرئيسية في مجال هجرة الخلايا المناعية، مثل كيفية إرسال الهيكل الخلوي للقوات القص وكيف تؤثر الليغانات وكيموكينات اللاتيثرين على الهجرة الناجمة عن تدفق الكريات البيض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه نوع جديد من فحص الهجرة الذي يسهل على المبتدئين القيام به. وهي لا تستخدم سوى المعدات والكواشف المتاحة تجاريا، فضلا عن البرمجيات الحرة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في الخلايا B المنطقة الهامشية، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على الخلايا المناعية الأخرى، مثل الخلايا التائية المنشط. في اليوم السابق للتجربة، ذوبان aliquot من ICAM-1، وتمييع في برنامج تلفزيوني إلى تركيز النهائي من خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر. ثم، إضافة 30 ميكرولتررس من ICAM-1 إلى الغرف المطلوبة من شريحة تدفق.

ضع الشريحة في غرفة رطبة ، وحددها عند أربع درجات مئوية لاحتضانها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وغسل الغرفة بإضافة 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى بئر واحدة ومن ثم سحب 100 ميكرولترات من بئر أخرى من الغرفة. ثم أضف 100 ميكرولترات من عازلة الحجب إلى غرفة، واحتضان الشريحة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بغسل الغرفة بإضافة 100 ميكرولترات من PBS إلى بئر واحدة ، وسحبها من البئر الأخرى ، ثم إضافة 100 ميكرولترات من عازلة الهجرة إلى الغرفة. الشريحة الآن جاهزة للاستخدام. تخزينه في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة حتى التجربة.

أولا، سد العجز في مضخة السوائل، وإرفاق وحدة fluidics. ثم، قم بتشغيل برنامج المضخة. بعد ذلك، قم بغسل الأنابيب مرة واحدة بخمس إلى 10 ملليلترات من مخزن الهجرة المؤقت.

هذا سيستغرق حوالي دقيقة واحدة. ثم، إضافة 11.7 ملليلتر من العازلة الهجرة بالتساوي إلى كلا الخزانين، وإزالة فقاعات الهواء. الآن، المشبك الأنابيب حوالي 10 سم من قطعة الرابط، ووضع وحدة fluidic في غرفة الحضانة ساخنة على المجهر.

في البرنامج، تعيين اختيار الشريحة إلى الشريحة الدقيقة VI 0.4 وخيار أنابيب إلى أبيض. أيضا، تعيين الإجهاد القص المطلوب إلى حوالي أربعة dynes لكل سنتيمتر مربع ووقت التصوير إلى 30 دقيقة. ثم، تعيين معدل التدفق المطلوب والإجهاد القص عن طريق إدخال القيم في برنامج المضخة.

المقبل، قبل الدافئة غرفة الحضانة المجهر، وحدة fluidics، و aliquots العازلة الهجرة إلى 37 درجة مئوية. مرة واحدة دافئة، واختبار مضخة سائلة، وضمان أن تدفق العازلة الهجرة ذهابا وإيابا في الخزانات وعدم وجود فقاعات الهواء في النظام. أولاً، عزل الكريات البيض، وتنقية خارج الخلايا المنطقة الهامشية B كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق.

ثم، تنظيف الجزء السفلي من الشريحة مع الأنسجة المثبطة الإيثانول. إضافة 30 ميكرولترات من تعليق الخلية في بئر واحد من الغرفة، وسحب 30 ميكرولترات من المخزنة العازلة الهجرة من بئر أخرى. غط الشريحة، وحضنها لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا بالتصاقها.

بعد ذلك، قم بإضافة احتياطي الترحيل المدفأة إلى كل بئر من الشريحة ببطء حتى يرتفع الغضروف المفصلي الموجب من البئر. إزالة أي فقاعات الهواء مع طرف ماصة. من المهم الحفاظ على الاتساق مع العوامل التي تؤثر على التصاق الخلية، لذلك الحفاظ على المخازن المؤقتة والخلايا في 37 درجة، وتجنب استخدام القوة المفرطة عند الأنابيب المخزن في الغرفة.

المشبك الشريحة إلى مرحلة المجهر، وإزالة الجانب غير ملحوظ من أنابيب fluidic من قطعة موصل. ثم، ملء نهاية الأنابيب مع العازلة الهجرة حتى الغضروف المفصلي إيجابية دون فقاعات الهواء ترتفع من النهاية. قم بقلب نهاية الأنبوب، ثم أدخله في البئر العلوي لغرفة التدفق.

مع الحفاظ على أنابيب فرضت، كرر الإجراء لنهاية ملحوظ من الأنابيب. الآن، قم بتبديل نظام التصوير إلى وضع Live، وحدد حقل عرض في منتصف الشريحة. هنا، تعيين التركيز على الخلايا، ومن ثم إلغاء التركيز قليلاً لتعزيز مخطط أسود للخلايا وإنتاج الداخلية البيضاء.

وسوف تكون خلفية سوداء ومركز أبيض أسهل للاستخدام في برنامج تتبع الآلي. قم بإعداد برنامج تسلسل التصوير لتسجيل صورة واحدة كل خمس ثوانٍ لمدة 30 دقيقة باستخدام هدف جاف 10x. ثم ابدأ التسجيل.

إزالة المشبك من الأنابيب، وتشغيل المضخة. وهذا سوف يسبب الخلايا غير المنضمة لغسل قبالة والخلايا المنضمة لبدء الهجرة. في نهاية برنامج التصوير، قم بتسمية الفيلم وحفظه.

إذا كان استخدام مانع أو معدل ترحيل الخلايا، يمكن إضافته إلى الخلايا الموجودة في تعليق الخلية قبل وضعها على الشريحة أو إلى المخزن المؤقت للهجرة في وحدة fluidics. لبدء تحليل مسار الترحيل التلقائي، افتح برنامج ImageJ. نسخ ملف Java MTrack2_kt إلى المجلد ملحقات ImageJ.

ضمن القائمة الإضافات، حدد ترجمة وتشغيل. ثم، إعادة تشغيل ImageJ، وينبغي أن تظهر البرنامج المساعد في القائمة الإضافات. افتح كومة الصور من فيلم ترحيل الخلايا في ImageJ، ثم قم بمعالجة الصور كما هو موضح هنا من أجل تحويل الفيديو من إطارات الألوان إلى صور عالية التباين تظهر الخلايا ككائنات سوداء على خلفية بيضاء.

بعد ذلك ، شحذ الصور مرتين ، despeckle الصور ، ومن ثم تحويل الصور إلى ثمانية بت. في قائمة الصورة، انتقل إلى القائمة الفرعية ضبط السطوع/التباين، ثم ضع شريط تمرير التباين في أقصى تباين. سيؤدي هذا إلى ظهور الخلايا ككائنات بيضاء على خلفية سوداء.

ثم، العودة إلى القائمة الفرعية عتبة ضبط للتأكد من أن تظهر الخلايا ككائنات سوداء على خلفية بيضاء. الآن، تشغيل التلقائي خلية تتبع البرنامج المساعد MTrack2 kt. على شاشة الخيارات، قم بتعيين الحد الأدنى لحجم الجسيمات إلى بكسل واحد والحد الأقصى لحجم الجسيمات إلى 30 بكسل.

تعيين قيمة السرعة إلى 10 بكسل، على الرغم من أن الخلايا المنطقة الهامشية B عموماً لن يتجاوز اثنين من بكسل على إطارات متتابعة التي هي خمس ثوان عن بعضها البعض. مسارات الخلية جاهزة الآن للتحليل باستخدام أداة ibidi Chemotaxis. إظهار هذين الحقلين مسارات الترحيل من الخلايا المنطقة "ب" هامشية التي تم seeded على الشرائح المغلفة ICAM-1.

تم تعقب الخلايا تلقائياً باستخدام MTrack2 باستخدام الطرق الموضحة في هذه المقالة. على اليسار، تم تصوير الخلايا في ظروف ثابتة، وعلى الخلايا اليمنى تعرضت لتدفق القص من أربعة dynes لكل سنتيمتر مربع. يمكن استيراد مسارات الخلية الفردية إلى أداة ibidi Chemotaxis لإنشاء مسارات المسار لكل فيلم.

هنا، مسارات الخلية الفردية هي الملونة الحمراء للإشارة إلى أنها انتهت المصب من نقطة الأصل أو الأسود إذا انتهت المنبع. يتم عرض تحليل مسارات الخلية من أربعة أفلام فردية لكل من تدفق والظروف لا تدفق هنا. وهذا يشمل متوسط مؤشر الهجرة الاتجاهي، وسرعة الخلية، وات المستقيمة في المسار، والمسافة النهائية للخط المستقيم لكلا الشرطين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير الهجرة الاتجاهية لخلايا المنطقة "ب" الهامشية نحو تدفق القص وكيفية تتبع الخلايا تلقائياً. خلال هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل المجهر TIRF للإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيف يمكن للcytoskeleton و integrins الاستجابة لتوتر القص؟